盐胁迫下12个甜荞新品种生理特性及FtNHX1基因表达差异的比较

为研究盐胁迫对甜荞生理特性及FtNHX1基因表达的影响,以12个甜荞新品种(平荞2号、定甜荞3号、赤甜荞1号、TQ11-3、T407-8、通荞2号、云甜荞1号、蒙0825、甜荞1307-179、平选03-122、TQ11-6和赤甜荞2号)为试验材料,盐胁迫下通过测定种子发芽率、幼苗鲜质量、根系活力、叶片质膜透性、MDA含量、SOD活性和根部FtNHX1基因表达量等指标,比较盐胁迫下12个甜荞新品种生理特性及FtNHX1基因表达的差异。结果表明,盐胁迫下定甜荞3号和赤甜荞1号种子发芽率及幼苗鲜质量降低幅度较大,而平荞2号和T407-8种子发芽率与对照无显著差异,且盐胁迫对这2个甜荞品种幼苗生长有明显促进效应;定甜荞3号和赤甜荞1号叶片质膜透性和MDA含量增加幅度较大,而平荞2号和T407-8叶片质膜透性与对照无显著差异,且叶片MDA含量增加幅度较小;定甜荞3号和赤甜荞1号根系活力和叶片SOD活性降低幅度较大,而平荞2号和T407-8根系活力降低幅度较小,且叶片SOD活性显著增加,抗逆性强;定甜荞3号根部FtNHX1表达量显著降低,而平荞2号和T407-8根部FtNHX1基因表达量显著增加,耐盐性强。确定平荞2号和T407-8为甜荞耐盐品种,定甜荞3号和赤甜荞1号为盐敏感品种。     

两个小麦新品种的耐盐性分析

为了研究不同浓度NaCl胁迫对小麦生理特性及TaNHX1基因表达的影响,以鲁原502和青麦6号2个小麦新品种为试验材料,50,100,150,200 mmol/L NaCl胁迫下测定2个小麦品种种子发芽率、幼苗鲜质量、根系活力、质膜透性、MDA含量、Na~+含量等生理指标,并通过荧光定量PCR方法对小麦耐盐基因TaNHX1在根部和茎基部的表达量进行了比较。结果表明,100 mmol/L以上浓度NaCl胁迫下青麦6号种子发芽率显著高于鲁原502;低浓度NaCl胁迫对青麦6号幼苗生长具有显著促进效应,150 mmol/L NaCl胁迫下青麦6号幼苗鲜质量显著降低,而鲁原502幼苗鲜质量在100 mmol/L NaCl胁迫下就开始显著降低;高浓度NaCl胁迫下鲁原502根系活力下降幅度显著大于青麦6号;相同浓度NaCl胁迫下鲁原502叶片质膜透性和MDA含量均显著高于青麦6号,说明NaCl胁迫对青麦6号叶片细胞质膜伤害较小;高浓度NaCl胁迫下青麦6号根部和茎基部Na+含量均显著高于鲁原502,说明青麦6号根部和茎基部的拒Na+能力显著大于鲁原502,可以有效限制Na+向地上部运输;鲁原502和青麦6号的TaNHX1基因分别在100,150 mmol/L NaCl胁迫下达到最高表达量。以上结果说明青麦6号比鲁原502更耐盐,鲁原502的最高耐盐浓度为100 mmol/L,青麦6号的最高耐盐浓度为150 mmol/L。     

烟草NtNHX1-1基因特征分析

烟草是中国重要的经济作物之一。盐胁迫对烟草生产造成巨大危害,克隆盐胁迫响应基因,为从分子水平抵御盐胁迫提供基因资源。本研究克隆了Na+/H+反向转运蛋白基因。该基因编码的蛋白为膜蛋白,具有12个跨膜区。进化分析表明,Nt NHX1-1与番茄的Sl-NHX1遗传距离最近,相似性为95%,其次为甜辣椒的Ca-NHX2,相似性为94%。组织特性表达分析表明,NtNHX1-1基因在茎中表达最高、其次为叶、花和根。NaCl处理后NtNHX1-1基因的表达明显上调,表明该基因可能在烟草抵抗盐胁迫中发挥重要功能。通过调控NtNHX1-1基因的表达有望获得耐盐胁迫烟草新品系。     

马铃薯青薯九号甜菜碱醛脱氢酶基因(StBADH)克隆及进化分析

本研究利用同源克隆,从马铃薯青薯9号中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶基因,分别命名为St BADH-504和St BADH-505。St BADH-504为1 631 bp,CDS为1 515 bp,编码504个氨基酸蛋白,编码蛋白亚细胞定位于线粒体;St BADH-505为1 709 bp,CDS为1 518 bp,编码505个氨基酸蛋白,编码蛋白亚细胞定位于叶绿体或过氧化物酶体,二个蛋白都有醛脱氢酶高度保守的十肽(VSLELGGKSP)结构。进化分析表明,St BADH-504和St BADH-505蛋白与茄科植物中BADH蛋白聚为一类,但二者分属不同分支。盐胁迫表达特征分析表明,马铃薯叶片中St BADH-504表达受盐胁迫的诱导,而St BADH-505为组成型表达,不受盐胁迫诱导。本研究有助于了解马铃薯耐盐机理,为耐盐马铃薯资源创制提供理论参考。     

陆地棉离层基因GhBOP1的克隆及其功能的初步分析

为防止棉铃脱落提高结铃性,进而提高棉花产量,从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因GhBOP1。通过生物信息学分析,表明GhBOP1蛋白序列含有保守性强的BTB和ANK结构域;进化树分析显示该蛋白氨基酸序列与许多植物的同源蛋白相似程度很高,说明该类蛋白进化较慢。利用qRT-PCR进行组织特异性表达分析的结果表明,GhBOP1基因在根、茎、叶和花等组织器官中均有少量表达,但在离层中为优势表达,表达量为叶片表达水平的20倍。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术干涉棉花GhBOP1基因的表达,同时进行低盐胁迫处理分析,对照植株叶片出现大量地脱落,而GhBOP1基因沉默植株叶片生长正常。总之GhBOP1基因在离层中优势表达,并对离层的形成可能具有调控功能。     

红麻液泡膜质子泵H~+-PPase(Hcvp1)基因的克隆、序列分析和表达

为了阐明红麻耐盐机理,以耐盐性较强的中红麻16号为材料,从红麻耐盐转录组测序结果中获得了1个与AVP1基因高度相似的Unigene,根据该片段的序列设计引物,直接进行PCR扩增,经Sanger测序获得该基因全长c DNA序列。对该基因序列进行生物信息学分析表明:该基因全长2 298 bp,开放阅读框为2 298 bp,编码765个氨基酸,其编码蛋白质的分子量和等电点分别为80.2 k Da和5.25,与雷蒙德氏棉、甜橙、毛果杨、烟草和大豆的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分别为90%,85%,85%,83%,83%,蛋白质序列的相似性分别为96%,93%,91%,93%,94%,说明该基因与AVP1为同源基因,命名为Hcvp1。qRT-PCR分析表明,该基因的表达量随着Na Cl浓度的增加而增加。这将为Hcvp1基因的功能验证和红麻耐盐机理的研究奠定坚实的基础。     

蓖麻环核苷酸门控离子通道RcCNGC2克隆与盐胁迫下表达分析

为探讨RcCNGC2在蓖麻耐盐中的作用,以通蓖5号叶片为材料,克隆获得环核苷酸门控离子通道RcCNGC2完整编码区序列(CDS),并对该序列进行序列比对、蛋白结构分析,构建多元表达载体,分析了在盐胁迫下蓖麻RcCNGC2基因根、茎、叶组织中6个时间点的表达量变化。结果显示,RcCNGC2 CDS长度为2 148 bp,编码715个氨基酸,蛋白分子量为34.15 ku,等电点为9.96,存在5个跨膜结构域。氨基酸序列一致性分析表明,RcCNGC2与橡胶树一致性最高,达89.15%。qRT-PCR分析结果显示,NaCl处理后RcCNGC2表达量在根中上调且差异显著,在茎、叶中随NaCl处理时间延长而显著减少。综上,RcCNGC2在蓖麻受到盐胁迫时起重要信号传导作用。     

施氏假单胞菌Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA的克隆与表达分析

Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。利 用PCR技术从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA。序列分 析表明,该基因全长1167 bp,编码388 个氨基酸,含有12 个跨膜结构域和保守的功能氨基酸残基位点： Asp-133、Asp-163、Asp-164、His-225、Gly-338。与大肠杆菌nhaA 基因核苷酸和编码氨基酸序列的同源 性分别为99%和99.2%。将该基因与pET-28a 构建成原核表达载体pET-nhaA,转化E.coli BL21,经IPTG 诱导后获得相对分子量约为41 kD的蛋白。平板法和生长曲线法检测表明,重组菌在800 mmol/L NaCl 胁迫下仍能正常生长,耐盐能力显著提高。以上结果证实克隆到的基因是施氏假单胞菌nhaA 基因家族 的成员,具有盐胁迫下将Na+逆向转运至胞外的功能,为进一步利用该基因进行作物耐盐改良奠定了基 础。该基因的GenBank登录号为EU545468。     

药用野生稻ADF基因的克隆及其抗逆性分析

为了研究ADF基因对药用野生稻非生物胁迫的影响,利用药用野生稻干旱胁迫转录组数据分析的基础,通过PCR技术克隆OoADF1基因,序列分析结果表明,OoADF1的开放阅读框长度为453 bp,无内含子,编码150个氨基酸残基,具有典型的ADF结构域。qRT-PCR技术分析表明,OoADF1在四叶期的叶片、叶鞘和根,以及抽穗期的叶片、叶鞘、茎和幼穗等7个组织中均表达,四叶期根部表达量最高,抽穗期叶鞘表达量最高。干旱和高盐胁迫后,OoADF1表达量分别上调了17.9,40.0倍。将OoADF1完整的编码序列融合到原核表达载体p ET-28a(+)中,通过IPTG诱导及SDS-PASGE检测表明,OoADF1编码的蛋白分子量约为16 kDa,与预测的相符。OoADF1在大肠杆菌中的表达增加了大肠杆菌对高盐的抗性,表明OoADF1对高盐胁迫具有一定程度的响应能力,从而使得细胞免受高盐的毒害。     

水稻LRR-RLK基因LP7的克隆及表达分析

LRR-RLK是类受体蛋白激酶RLK家族中最大的亚家族,在调控植物非生物胁迫等方面具有重要作用。为解析水稻LRR-RLK成员LP7(LOC_Os05g24010)在耐低磷胁迫中的作用,从水稻品种日本晴中克隆了LP7全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列,研究其组织表达模式、亚细胞定位及低磷胁迫下的表达变化。结果表明,LP7基因全长2 832 bp,编码943个氨基酸,LP7蛋白具有典型的LRR-RLK成员特征,LP7蛋白与玉米中的同源蛋白NP_001131018同源性比较高,同源性高达77%。组织表达模式分析表明,LP7基因在根、茎、叶等组织中均表达,在叶中表达量最高。亚细胞定位结果表明,LP7蛋白定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR分析表明,LP7基因受低磷胁迫诱导表达,其表达量较正常培养条件下增加15倍。初步推测该基因可能在水稻响应低磷胁迫中具有重要作用。     

过表达FtbZIP5提高苦荞毛状根黄酮积累及其耐盐性

bZIP转录因子不仅在植物盐胁迫网络中起着重要的作用,还可调节植物类黄酮的积累。在苦荞品种川荞1号中克隆了1个具有转录激活活性的bZIP家族基因FtbZIP5。FtbZIP5基因能被NaCl和脱落酸（ABA）诱导表达,在茎和叶中的表达高于根中。对过表达FtbZIP5基因毛状根的总黄酮含量进行检测,结果显示,总黄酮含量在过表达株系中显著高于野生株系。同时检测其类黄酮合成途径中关键酶基因的表达量,其中黄烷酮-3-羟化酶基因（F3H）的表达量较高。可推测该过表达毛状根株系中总黄酮的积累与F3H的表达有关。在NaCl（100mmol/L）胁迫下,各株系的总黄酮积累受到抑制,过表达株系的含量减少至0.63mg/g。并且,在这种压力下,F3H的表达水平仍然高于对照。植株在受到胁迫后,对照株系的过氧化氢酶（CAT）活性显著低于过表达株系。随着野生型植株受到胁迫的增强丙二醛（MDA）含量增加,但过表达株系的含量趋于稳定。以上结果表明,在过表达FtbZIP5毛状根中,总黄酮的积累可能是通过关键酶基因F3H的上调表达来调节的。并且FtbZIP5可提高苦荞毛状根耐盐性。通过解析FtbZIP5对苦荞毛状根中总黄酮积累及植株耐盐性的影响,为荞麦耐盐性和解析其耐盐机制研究奠定基础。     

3个苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性评价

为研究不同苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性,以3个苦荞品种野鸡苦荞、宁苦2号和湖南苦荞7-2为材料,采用盆栽试验,分别用0、50、100、150mmol/L NaCl溶液处理,通过观察和测定幼苗叶片形态特征、幼苗生长指标和生理生化指标,采用隶属函数分析法对不同苦荞品种耐盐性进行综合评价。结果显示,在盐胁迫下3个苦荞品种叶片出现失水皱缩和黄化腐烂的症状,以高浓度伤害最明显;随NaCl浓度的升高,3个苦荞品种的鲜重、干重、株高、茎粗和根长均表现出下降趋势;叶绿素、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性呈先上升后下降趋势,以100mmol/L处理最高,过氧化物酶活性和相对电导率呈上升趋势,以150mmol/L处理最高;根系活力呈下降趋势,以150mmol/L处理最低。经过隶属函数分析及综合评价,3个苦荞品种耐盐性表现为宁苦2号>湖南苦荞7-2>野鸡苦荞。     

苦荞鼠李糖基转移酶FtF3GT1基因的克隆与转化毛状根研究

苦荞中的黄酮类化合物具有很高的药用价值和保健功能。以苦荞川荞1号为材料,克隆出FtF3GT1基因,其CDS全长为1 401bp,编码467个氨基酸。系统发育分析表明,FtF3GT1与甜荞中的FeUF7GT蛋白亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,FtF3GT1基因在各个组织中均有表达,在根部最低,在茎部最高;MeJA处理苦荞和转pCAMBIA3301:FtF3GT1pro::GUS毛状根中发现,FtF3GT1基因的表达量以及GUS的活性明显受MeJA诱导;转过表达FtF3GT1基因毛状根中,总黄酮含量明显升高,推测FtF3GT1基因可促进黄酮类物质的合成。     

苦荞漆酶基因的克隆与生物信息学分析

利用RT-PCR技术从苦荞中克隆出2条漆酶（laccase）基因,运用生物信息学技术对2个基因序列进行分析,预测结构域、二级和三级蛋白结构,进行蛋白同源比对及进化树分析。结果表明,FtLAC-1基因序列开放阅读框为1695bp,编码564个氨基酸,FtLAC-2基因序列开放阅读框为1707bp,编码568个氨基酸。FtLAC-1和FtLAC-2蛋白预测分子量分别为61.41和62.47kDa,理论等电点分别为9.45和9.41,为亲水性蛋白,2个基因序列相似性较低,氨基酸序列同源性不高。qRT-PCR分析出其在苦荞不同组织器官存在差异性表达。结论为进一步探索FtLAC-1和FtLAC-2在苦荞薄果壳形成中的功能提供理论基础。     

渗透胁迫和盐胁迫对荞麦硝酸还原酶及亚硝酸还原酶活性的影响

以盐敏感荞麦品种TQ-0808和耐盐荞麦品种川荞1号为试验材料,采用NaCl和等渗PEG-6000处理,研究渗透胁迫和盐胁迫对不同耐盐性荞麦品种硝酸还原酶(NR)及亚硝酸还原酶(NiR)活性的影响。结果表明,高浓度盐胁迫下盐敏感荞麦品种叶片NR及NiR活性显著降低,而耐盐荞麦品种降低幅度相对较小,且高浓度盐胁迫下盐敏感荞麦品种叶片NR及NiR活性的降低幅度明显大于渗透胁迫的,说明Na⁺毒害效应发挥了主要作用。另外,两个荞麦品种叶片NR活性高低与其叶片硝酸盐含量呈正相关。     

棉花幼苗根系响应NaCl胁迫的差异蛋白组学分析

为了探讨盐胁迫对棉花幼苗根系蛋白表达谱的影响,丰富棉花在分子水平上应对盐胁迫的机理,本研究对盐胁迫下棉花幼苗根系进行差异蛋白组学分析。试验利用1%NaCl模拟盐胁迫,对陆地棉品种‘中棉69’进行72 h处理,利用磷酸盐缓冲液研磨后再用月桂酸辅助三氯醋酸沉淀的方法获得棉花幼苗根系蛋白样品,并进行双向电泳分离,获得了分辨率较高、背景清晰的差异蛋白表达图谱。图谱分析显示,共有36个棉花幼苗根系蛋白点响应盐胁迫,其中16个表达量显著上调,20个表达量显著下调。对其中的10个表达差异的蛋白进行了质谱分析和同源蛋白鉴定,结果显示它们分别为抗坏血酸过氧化物酶、烯醇化酶、谷胱甘肽-S-转移酶、醌氧化还原酶、膜联蛋白AnxGb3、叶绿体Rubiso大亚基蛋白结合α亚基、P23蛋白、果糖激酶、乙醇脱氢酶、腺嘌呤磷酸转移酶1亚型1。本研究结果显示盐胁迫下有部分棉花幼苗根系蛋白显示显著差异表达,表明这些蛋白可能参与棉花抗（耐）盐的信号、代谢途径中。     

不同水分条件下不同抗旱性苦荞根系生长规律研究

为了探明不同抗旱性苦荞根系形态和生理特性与抗旱性的关系,为干旱胁迫下苦荞高产优质栽培管理及抗旱品种的筛选提供理论依据,采用人工控水的方法,研究并分析了正常供水、重度干旱条件下不同抗旱性苦荞品种迪庆苦荞（耐旱）、黑丰1号（旱敏感）根系生长形态和生理指标变化。结果表明,干旱胁迫显著增加了苦荞根冠比、根系丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量,而最大根长、根体积、根表面积显著降低。随着生育期推进,各处理苦荞最大根长、根体积、根表面积、MDA含量等指标均呈现逐渐增加趋势,根冠比、Pro含量呈现先增后减趋势。品种之间方差分析结果表明,重度干旱胁迫条件下,各测定时期迪庆苦荞的根冠比、最大根长、根体积、根表面积、根系Pro含量均显著高于黑丰1号,MDA含量则显著低于黑丰1号。回归分析表明,不同处理苦荞根表面积、最大根长等指标在测定时期内随时间变化的数学模型均符合指数函数,根体积、MDA含量等指标均符合一元二次方程的规律。干旱胁迫下苦荞根系与地上部分的生长均受到抑制,且表现为对地上部的影响大于对根系;与黑丰1号相比,迪庆苦荞耐旱性更强。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

不同苦荞品种花和籽粒空间分布特征及差异分析

以8个苦荞品种为试验材料,研究不同苦荞品种花和籽粒在植株不同部位的分布特征及差异。结果表明,不同苦荞品种花和籽粒总数存在显著差异,其中川荞2号总花数、总籽粒数最高,分别为3 046.6和1 367.8,而川荞1号最少,分别为1 017.6和487.2,品种间总花数和总籽粒数变异系数分别为34.8%、29.0%。不同苦荞品种花和籽粒空间分布呈现相同趋势,均主要分布于分枝上,分别占整株的76.3%和74.2%以上,且均显著高于主茎,分别高68.7%~87.0%和65.2%~84.5%。生产上可通过调控分枝的有效籽粒数来提高苦荞产量。