三株芽孢杆菌抑菌活性分析及对肉鸡舍空气微生物的影响

【目的】分析2株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的基本特性以及对大肠埃希氏菌（Escherichia.coli,CVCC1570）的抑制活性;分析3株芽孢杆菌复合制剂对肉鸡舍空气大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,为改善畜舍环境提供基础数据。【方法】对3株芽孢杆菌进行形态学观察、镜检和生长曲线测定,以大肠埃希氏菌（CVCC1570）为指示菌株,采用琼脂扩散法对单一菌株的抑菌特性进行测定,筛选出适宜的抑菌浓度;利用三因子三水平的正交试验设计,筛选出最佳抑菌效果的复合芽孢杆菌组合;鸡舍喷洒试验采用单因子设计,分为3个处理组,每个处理设3个重复,分别为空白对照组,化学消毒剂阳性对照组（苯扎氯铵）,喷洒复合芽孢杆菌菌剂处理组。在肉鸡不同日龄检测鸡舍内大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的变化规律。【结果】3株芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌。芽孢杆菌SKN01和芽孢杆菌SKN02生长曲线相近,在培养2h开始进入对数生长期。芽孢杆菌SKN03生长较缓慢,进入对数生长期的时间相对较长。单一菌株对大肠埃希氏菌有效抑菌浓度均为108CFU•mL-1。经正交试验测定,3株芽孢杆菌复合菌液最佳抑菌组合为4×108 CFU•mL-1、4×108 CFU•mL-1、6×108 CFU•mL-1。最佳组合复合芽孢杆菌喷洒鸡舍,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,在肉鸡生长后期复合制剂的抑菌效果明显。【结论】3株芽孢杆菌能够有效抑制大肠埃希氏菌,同时复合菌液能够有效减少鸡舍有害微生物的数量,起到改善鸡舍环境的作用。     

萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性

【目的】研究萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性,探索植物病害生物防治的新途径。【方法】采用滤纸片法和叶盘法,检测XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和叶盘抑菌活性,以及对该病菌菌丝和孢子萌发的影响;研究其对另外5种植物病原真菌(尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌)的抑菌活性,并分析其抑菌活性在不同的pH(2,3,4,5,6,7,8,9,10和11)、温度(30,40,50,60,70,80,90,100,110和121℃)、蛋白酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)、紫外线作用时间(1,2,3和4h)、金属离子(Li~+、Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ag~+)、表面活性剂(Tween 20和SDS)、抑制剂(EDTA)、氧化剂(H2O2)和常温保存时间(0.5,1,2,3,4,5和6个月)下的稳定性,最后分析XW2产细胞壁裂解酶的特性。【结果】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度为0.01mg/disc(5号滤纸片),能明显抑制杨树炭疽病菌在平板和杨树叶片上的生长,有效抑制孢子的萌发和附着孢的形成,并导致菌丝和萌发芽管产生膨大畸形;对尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌均有明显的拮抗活性。XW2胞外蛋白在110℃下处理30min及pH 6.0~9.0下均能保持较高的抑菌活性;对蛋白酶、紫外光照、金属离子(Li~+、Na~+、K~+、Ag~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+))、SDS和EDTA均不敏感,但Mn~(2+)和Fe~(3+)会抑制蛋白的抑菌活性,而Tween 20和H_2O_2则能提高其抑菌活性;在常温条件下保存6个月后,其抑菌活性并未发生明显丧失。细胞壁裂解酶检测发现,XW2能产生蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶。【结论】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性强、稳定性好且抑菌谱广,具有潜在的工业开发和田间应用前景。     

芽孢杆菌胞外产物对凡纳滨对虾蛋白酶活性影响的体外试验

用半透膜法收集地衣芽孢杆菌Bacillus licheniform isDe株的胞外产物(Extracellu lar products,ECP),以匀浆离心法提取凡纳滨对虾Litopenaeus vannam ei的肝胰腺和肠道消化酶,将ECP和对虾消化酶提取液按1∶9(体积比)混合,研究不同温度、pH条件下ECP对对虾蛋白酶活性的影响。结果表明:在不同温度、pH条件下,试验组与对照组没有显著性差异(P>0.05),即地衣芽孢杆菌ECP在体外条件下对对虾蛋白酶活性没有显著性影响;且试验组中芽孢杆菌ECP的添加量与其蛋白酶活性呈负相关。     

芽孢杆菌胞外产物对凡纳滨对虾蛋白酶活性影响的体外试验

用半透膜法收集地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis De株的胞外产物(Extracellular products, ECP),以匀浆离心法提取凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei的肝胰腺和肠道消化酶,将ECP和对虾消化酶提取液按1:9(体积比)混合,研究不同温度、pH条件下ECP对对虾蛋白酶活性的影响.结果表明:在不同温度、pH条件下,试验组与对照组没有显著性差异(P＞0.05),即地衣芽孢杆菌ECP在体外条件下对对虾蛋白酶活性没有显著性影响;且试验组中芽孢杆菌ECP的添加量与其蛋白酶活性呈负相关.     

1株解淀粉芽孢杆菌HN011抑菌次级代谢产物的分析

[目的]分离和鉴定生防菌HN011在YPD条件下发酵的次级代谢产物.[方法]HN011少量(1 L)发酵,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行液-液萃取,通过金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的活性试验跟踪确定活性部位;通过放大发酵,对活性部位进行分离得到单体化合物.利用核磁共振和质谱等手段,鉴定单体化合物.[结果]生防菌HN011少量发酵后,发酵液经不同极性的有机溶剂液-液萃取,萃取物的活性试验表明,乙酸乙酯部位活性最强,其次氯仿部位,正丁醇部位活性较弱,石油醚部位、水部位活性不明显.通过放大发酵,在活性部位分离出15个单体,结构鉴定表明,主要为小分子的环二肽.[结论]生防菌HN011在YPD的发酵条件下,次级代谢产物主要为一些小分子的环二肽.     

1株解淀粉芽孢杆菌HN011抑菌次级代谢产物的分析

【目的】分离和鉴定生防菌HN011在 YPD条件下发酵的次级代谢产物。【方法】HN011少量 (1 L) 发酵,分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行液-液萃取,通过金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的活性试验跟踪确定活性部位;通过放大发酵,对活性部位进行分离得到单体化合物。利用核磁共振和质谱等手段,鉴定单体化合物。【结果】生防菌HN011少量发酵后,发酵液经不同极性的有机溶剂液-液萃取,萃取物的活性试验表明,乙酸乙酯部位活性最强,其次氯仿部位,正丁醇部位活性较弱,石油醚部位、水部位活性不明显。通过放大发酵,在活性部位分离出15个单体,结构鉴定表明,主要为小分子的环二肽。【结论】生防菌HN011在YPD的发酵条件下,次级代谢产物主要为一些小分子的环二肽。     

解淀粉芽孢杆菌抗病机制研究进展

[目的]了解解淀粉芽孢杆菌抑病机制研究现状,以期为其生物类制剂研究与相关产品开发提供依据。[方法]通过文献检索,综述了解淀粉芽孢杆菌的生物学特性及主要代谢产物、抗病作用机理、对病害的拮抗和对土壤的改良效应等方面的研究进展。[结果]解淀粉芽孢杆菌通过分泌次生代谢产物破坏病原菌细胞结构;能够诱导寄主防御,提高与抗病性相关酶的酶活性;能产生抑制病原菌生长发育的挥发性物质;能够分解环境中难溶性微量元素,提高土壤肥力。[结论]解淀粉芽孢杆菌抑菌促生方面已有许多研究成果,应进一步提升其应用效果。建议对解淀粉芽孢杆菌进行多组学研究,并优化其生物制剂质量及使用方法,开发混合生物制剂等,使其微生物产品更加高效。     

枯草芽孢杆菌a1所产抗真菌活性物质的稳定性研究

在实验室分离得到的1株枯草芽孢杆菌a1,其代谢产物对油菜菌核病菌和灰霉病菌都有很好的抑制活性。研究pH,温度,光照等因素对其所产抗真菌物质活性的影响,结果表明,该菌株所产抗真菌活性物质具有很强的耐酸性,在光照和中性条件下活性稳定,在温度高于100℃,紫外光照射和碱性条件下不稳定。此外还发现a1菌株的遗传稳定性较好。     

芽孢杆菌产淀粉酶活性的研究

研究了9株芽孢杆菌产淀粉酶的情况并对酶活力进行了测定.37℃下淀粉培养基平板培养2～4d后采用碘液染色,观察是否有透明圈并测量计算透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值,初步确定产淀粉酶活性.然后采用3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS)对发酵培养基发酵培养提取的粗酶液进行酶活力测定,进一步确定产酶活性的大小.结果显示,Pab03、Pab02、Pab01菌株的酶活力最高,酶活分别为31.331MMU、21.521MMU、17.269MMU.     

黄芪多糖和枯草芽孢杆菌代谢产物在PK-15细胞上对TGEV的影响

为了研究黄芪多糖和枯草芽孢杆菌代谢产物在PK-15细胞上对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的影响,在TGEV感染PK-15细胞时分别加入枯草芽孢杆菌代谢产物、黄芪多糖以及联合物,采用MTT法检测其病毒抑制率,荧光定量PCR法检测枯草芽孢杆菌代谢产物及黄芪多糖联合后对TGEV N及IFN-γmRNA表达量的影响。结果表明:枯草芽孢杆菌代谢产物具有抗TGEV作用,单独使用黄芪多糖同样能抑制TGEV感染PK-15细胞,联合处理后病毒抑制率显著上升。荧光定量PCR结果表明,经过联合物处理的PK-15细胞中的TGEV N基因表达量显著降低,3 h和6 h时PK-15细胞内的IFN-γmRNA表达量显著上升。     

海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1变异菌株的特性及其抑菌作用研究

为了明确海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GM-1自发突变菌株的变异与抗菌作用的关系,进一步获得优良菌种,通过形态学观察、生理生化试验及16S r DNA和gyr B基因序列分析,对变异菌株GM-1-2特性进行分析;以8种植物病菌为供试菌,采用平板对峙法和牛津杯法分别测定变异菌株GM-1-2及其发酵液的抑菌作用;采用硫酸铵沉淀法对变异菌株产生的抑菌物质进行初步分析。结果发现,变异菌株GM-1-2的菌落形态、颜色、菌体大小与原始菌株GM-1存在明显差异,但其生理生化特性、16S r DNA和gyr B序列与解淀粉芽孢杆菌的同源性等均与原始菌株相同。变异菌株GM-1-2及其发酵液对小麦根腐病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、大豆菌核病菌、小麦雪腐病菌、甘蓝枯萎病菌、斑点落叶病菌、黄瓜枯萎病菌的菌丝生长均有较强的抑制作用,且抑制作用明显高于原始菌株GM-1,其中菌株的抑菌带宽度提高了0.2~9.0 mm,无菌发酵液的抑制率提高了1.1%~153.7%。变异菌株的抑菌物质主要存在于硫酸铵沉淀中,沉淀后的上清液无明显的抑菌作用。以上结果表明,变异菌株GM-1-2的抑菌活性提高,其产生的抑菌物质与原始菌株存在差异,具有潜在的开发价值。     

小麦内生枯草芽孢杆菌E1R-j胞外抗菌蛋白的分离纯化和性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、疏水层析、PAGE切胶电洗脱、阴离子交换层析从E1R-j发酵滤液中分离纯化得到抗菌蛋白j1.经测定,j1分子量为51.9 kDa,等电点为8.7.j1不能催化昆布多糖、壳聚糖、羧甲基纤维素的水解;但能催化酪蛋白水解,其相对蛋白酶活性为384.67 U/mL.j1对蛋白酶K不敏感,具有很好的热稳定性(121℃),在pH 5～9 范围内表现稳定.对供试的5种病原真菌,j1仅对小麦全蚀病菌和苹果轮纹病菌有抑制作用.其中,对小麦全蚀菌的抑制中浓度IC50为 0.14 μg/mL.     

1株多粘类芽孢杆菌产菊粉酶粗酶学性质的研究

[目的]研究1株多粘类芽孢杆菌所产菊粉酶的粗酶学性质。[方法]以菊芋菊粉为底物发酵培养了1株多粘类芽孢杆菌,利用超声波法破碎细胞,得到该菌的菊粉酶粗提液,并对菊粉酶的粗酶学性质进行了研究。[结果]这株多粘类芽孢杆菌最佳产酶时间约在摇瓶发酵培养40h时,所产的胞内菊粉酶的菊粉酶活力与蔗糖酶活力之比（I/S）为0.2187,小于10,表现为外切酶活性。该酶反应的最适温度和最适pH值分别为45℃和5.0,在此条件下菊粉酶酶活力最高,可达102.81U/L。[结论]这株多粘类芽孢杆菌所产菊粉酶为外切酶,该酶的粗酶学性质研究为进一步深入系统地研究菊粉酶的酶学性质奠定了基础。     

培养条件对雪茄烟优势菌株 ZLX10 生长的影响

【目的】微生物在雪茄烟叶发酵过程中起关键作用,为更好地提高雪茄烟品质,需要筛选雪茄优势菌并应用于雪茄烟叶发酵,为此需优化扩大优势菌株的生物量。【方法】对从雪茄烟中筛选出的一株优势菌株ZLX10进行16S测序、生理生化分析以及菌株鉴定,同时通过单因素和正交试验优化培养基成分（碳源、氮源和无机盐）及培养条件（接种量、装液量和种龄）,以提高其生物量。【结果】经16S rDNA序列比对,菌株ZLX10与莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis,MT043920.1）的序列同源性达到99.86%,该菌株具有很强的多糖和蛋白大分子降解能力,可以鉴定为莫海威芽孢杆菌。经单因素和正交试验得到菌株ZLX10的最优培养基配方为碳源（蔗糖）50 g/L、氮源（酵母提取物）20 g/L、无机盐（MgSO4） 0.25 g/L,最佳培养条件为接种量1%(V/V)、装液量为250 mL中装30 mL、种龄24 h。在最优培养条件下培养24 h,菌株ZLX10的生物量是优化前的1.98倍。【结论】通过优化条件可以明显提高菌株ZLX10的生物量,为应用于人工接种发酵雪茄烟叶提供基础。     

生防菌菌株A的摇瓶培养条件及发酵工艺

[目的]优化生防菌菌株A的培养条件与液体发酵工艺。[方法]采用均匀试验设计方法、回归分析方法和分批补料发酵工艺,研究生防菌菌株A的培养条件与液体发酵工艺的优化。[结果]结果表明,适合菌株A摇瓶培养的最佳条件为：培养温度35℃,摇瓶装量12％,接种量3．0％,初始pH值7．2。20L发酵罐分批补料发酵参数为：种子培养基为YDC培养基,培养时间24h,接种量3．0％;发酵培养基：葡萄糖1．0％,酵母膏1．0％,CaCO3 1．0％,pH值7．2;流加培养基：葡萄糖1．5％,酵母膏0．5％,制成混合液一起流加,发酵8h开始流加;发酵周期（34±2）h,在以上发酵条件下,发酵液芽孢浓度达（3．410±0．151）×10^9cfu／ml。[结论]该试验条件下所获得发酵液芽孢数浓度较高,可用于进一步制备生防菌剂。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ib6基因的克隆、表达及活性的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)能产生杀虫晶体蛋白(Insecticida Crystal Proteins, ICPs),对敏感昆虫有强烈毒性,而对高等动物和人无毒性。ICPs由cry或cyt基因编码,根据cry1I型基因设计引物,以Bt LB52菌株的质粒DNA为模板,扩增出了全长为2.1 kb的cry1I基因,其能通过表达载体pEB在大肠杆菌中高效表达为79.9 kDa的蛋白。经过AlginX软件分析该蛋白由712个氨基酸组成,分子量为79.9 kDa,等电点为6.54,为弱酸性蛋白质,NCBI Blast比对该蛋白的氨基酸序列与Cry1Ib3的相似性最高为98%,有12个氨基酸的差异。该基因已在GenBank中注册,登录号为ADK38579,并被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ib6。它的表达产物对小菜蛾具有较高的毒力,LC50为1.196 μg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。     

三株芽孢杆菌对大肠杆菌的体外拮抗作用研究

以3株芽孢杆菌为材料,采用与致病性大肠杆菌同时接种及先后接种的方法,对其与大肠杆菌的生物拮抗作用进行了研究。结果表明:X1、X2、X33株芽孢杆菌与大肠杆菌同时接种培养后对大肠杆菌均有一定的抑菌效果,共培养8h后开始呈现一定的抑制作用,24～48h时作用最明显;先接种X1、X2、X33株芽孢杆菌培养24h后再接种大肠杆菌,对大肠杆菌均呈现明显的抑制作用,12h后开始呈现一定的抑制作用,24h时作用最明显,至48h时也还有一定的抑制作用;X3对沙门氏杆菌没有抑制作用。先接种大肠杆菌培养12h后再接种X1、X2、X33株芽孢杆菌对大肠杆菌也呈现明显的抑制作用,8h后开始呈现一定的抑制作用,12h时作用最明显,至24h时抑制作用基本消失。     

中国被毛孢RCEF0273培养工艺的研究

以提高菌丝生物量为目的,对中国被毛孢RCEF0273菌株的固体和液体培养工艺进行研究.结果表明,固体培养的最佳氮源为奶粉,其后依次为黄豆粉、酵母粉和麸皮,最差的为蛋白胨和NH4NO3;碳源对此菌的生长影响较小,比较适合的碳源为葡萄糖、蔗糖和果糖,其次为乳糖、淀粉等.应用正交设计方法研究接种量、CMC浓度以及添加玻璃珠的数量对菌丝生物量的影响,结果显示,30%的接种量可显著提高菌丝的生物量,而添加CMC或玻璃珠不利于菌丝生长.     

一株链霉菌脂肽类抗生素SMN的分离、纯化及生物学活性的研究

[目的]初步研究1株链霉菌中的活性物质SMN的分离纯化及其生物学活性。[方法]对链霉菌中的活性物质SMN进行分离和纯化,并研究SMN的抑菌谱和抗肿瘤活性以及Ca2+对其抑菌活性的影响。[结果]采用大孔吸附树脂来吸附链霉菌发酵物中的活性物质,吸附量大,解吸附容易,操作简单方便。通过HPLC比较不同大孔吸附树脂吸附活性物质的峰面积,国产的大孔吸附树脂AB-8和D312均高于进口树脂Diaion HP20。SMN仅对革兰氏阳性菌尤其耐药菌株有抑制活性,且抗菌活性具有Ca2+依赖性,对6种肿瘤细胞也有不同程度的抑制效果。SMN的抗癌活性与药物剂量和作用时间呈正相关性。[结论]活性物质SMN在抗菌和抗肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。     

枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的性质及对魔芋软腐病菌的抑制作用

以枯草芽孢杆菌为试验材料,以魔芋软腐病致病菌胡萝卜软腐欧文氏杆菌属胡萝卜软腐菌亚种(Erwinia carotovora var.carotovora,简称软腐菌)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aure,简称金葡菌)作指示菌,采用抑菌圈法,利用不同浓度硫酸铵盐析分离抗菌蛋白.结果表明,30%硫酸铵处理盐析的蛋白对软腐菌的抑菌活性最高;抗菌蛋白对软腐菌的抗菌活性在室温至60℃处理10 min时无明显影响,70℃处理10min,其活性仅下降17.1%;在pH值5.5～10.0的范围内抗菌蛋白活性无明显变化;经过氯仿处理后抗菌蛋白活性保持最好;胃蛋白酶可降解部分抗菌蛋白.