棉花半乳糖基转移酶基因GhGalT1启动子的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T₃代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

甘薯几丁质酶基因IbChiA启动子的克隆及功能分析

几丁质酶能够水解真菌细胞壁,抑制真菌的生长与繁殖,水解产物还能诱导植物的系统抗性,在植物抗病过程中发挥重要的调控作用。本实验室前期从甘薯中克隆了几丁质酶基因IbChiA并对其进行了功能验证和表达分析,结果表明黑斑病菌强烈诱导IbChiA基因的表达,且在不同抗性甘薯品种中的表达差异显著。在此基础上,本研究在抗感品种中分别克隆了IbChiA基因的2 034 bp的启动子序列,对比后发现其序列并无差异。PlantCARE在线分析显示,IbChiA启动子中包含核心元件TATA-box和CAAT-box,还有响应真菌诱导的作用元件(W-box)以及植物激素等相关的顺式作用元件。将IbChiA基因的全长启动子及7个启动子5’端缺失片段分别替换植物表达载体pHB的2xCaMV 35S启动子,并在本生烟草叶片中进行瞬时表达。eGFP的荧光及定量表达分析显示在基因上游600 bp及以上都能够正常稳定地发挥启动子的功能,其中在-1 605～1 188 bp的片段内可能存在增强转录的顺式作用元件。本研究为进一步探索甘薯IbChiA基因的调控和表达机制提供了理论依据,并为甘薯抗病基因工程提供了一个理想的候选启...     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

小麦蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α启动子的克隆及表达分析

植物蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)由结构亚基A、调节亚基B和催化亚基C组成,在应答逆境胁迫途径中发挥着重要作用。小麦基因Ta PP2Ab B″-α是调节亚基亚家族B″的成员,过量表达该基因可以促进拟南芥的根系生长及侧根发育,在盐胁迫和渗透胁迫条件下的作用更显著。本研究从小麦(Triticum aestivum L.)抗旱品种"旱选10号"基因组中克隆了Ta PP2Ab B″-α基因的启动子PB″α,序列长度为1899 bp,含有TATA-box和CAAT-box,以及响应干旱和渗透胁迫的顺式作用元件EECCRCAH1(?1058 bp至?1052 bp)、GCCCORE(?1073 bp至?1068 bp)和MYCCONSE(?1179 bp至?1174 bp)。将启动子PB″α和5种5′端缺失启动子片段与报告基因GUS(β-glucuronidase)连接后转化拟南芥,组织化学染色结果显示PB″α在植株的叶片和根中均有表达。5′端缺失分析表明缺失片段PB″α-1545和PB″α-1389具有启动子活性,活性区域位于?1389 bp和?946 bp之间。GUS定量分析结果显示,在盐和渗透胁迫条件下,PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389的活性显著上升。本研究表明PB″α具有较强的启动子基本活性,并且在盐胁迫及渗透胁迫条件下活性显著上升,该结果为合理选用启动子改良作物提供了依据。     

桃PG基因启动子克隆及序列分析

为获得桃多聚半乳糖醛酸酶( PG)基因启动子并分析调控元件,以桃品种大久保基因组DNA为模板,采用染色体步移技术克隆了PG基因的部分序列及其5′侧翼区,并分析其调控元件组成。结果表明,克隆产物长986 bp,3′侧翼序列与 GenBank中的PG基因序列的5′端部分序列同源性为96%,登录号为FJ940722。在789~839 bp位置存在基础启动子序列,转录起始位点位于828 bp的碱基C,其可能性为0.98。除含有CAAT-Box、TATA-Box等基本启动子元件外,还存在众多参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、水杨酸响应元件等应答激素和胁迫信号元件,表明PG基因的转录和表达可能受到激素、干旱、光照等外界环境的胁迫以及衰老的调控。     

茉莉花MK基因及启动子克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。本研究以茉莉花转录组测序数据为基础,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从双瓣茉莉花中获得甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)基因,命名为JsMK(GenBank登录号为MH311040)。测序结果显示JsMK全长cDNA为1608 bp,包含开放阅读框(ORF)1164 bp,编码387个氨基酸。生物信息学分析结果表明该基因编码的蛋白可能定位于细胞质中,为非亲水性稳定蛋白,含有与其他MK蛋白所共有的3个保守区,以及GHMP家族特有的N端保守区和C端保守区。Blast比对和系统进化树分析结果表明,JsMK蛋白与野生油橄榄、长春花等多种植物的MK蛋白同源性较高。采用染色体步移技术(Genenome walking technique)扩增MK基因5’端上游调控序列,获得709 bp启动子序列,PlantCare分析表明该序列含有大量基本顺式作用元件TATAbox、CAATbox,还存在生长素(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)等激素响应激素及多个光响应顺式调控元件。利用实时荧光定量PCR检测Js MK在IAA、MeJA、ABA处理下的表达水平。结果表明,JsMK同时受IAA、MeJA及ABA不同程度的诱导表达,其中MeJA对其诱导最明显。本研究通过从茉莉花中克隆并分析JsMK基因及其启动子序列,为进一步研究JsMK基因在萜类合成调控的功能提供科学依据。     

猪STAB2基因启动子的克隆及转录活性分析

旨在克隆和分析猪STAB2基因启动子及其转录活性。利用基因克隆、双荧光素酶报告基因系统以及生物信息学分析等方法,克隆得到了STAB2基因转录起始位点上游1 997 bp的候选启动子序列并对其序列特征进行了分析,同时,构建了不同长度的5'端缺失的重组载体并利用双荧光素酶报告基因系统分析了其荧光素酶活性,进而确定了STAB2基因的核心启动子区域及关键调控区域,并对关键调控区域内的转录因子及其结合位点进行了分析。结果表明:STAB2基因的候选启动子区域内包含4个核心启动子和1个Cp G岛;-309--39 bp为STAB2基因的关键调控区域,-1 045--309 bp可能存在一个正向调控元件,而-1 506--1 045 bp可能存在一个负向调控元件; STAB2基因的关键调控区域内包含72个转录因子结合位点,部分转录因子在这一区域具有多个结合位点,如Arnt∶∶Ahr、ZNF354C、Klf4和KLF5,并且,转录因子结合位点之间也存在重合区。为进一步研究猪STAB2基因的表达调控机制以及其在调控猪抗病和肌肉品质中的功能提供了理论依据。     

巴戟天MoTPS基因及其启动子克隆与分析

为探究巴戟天中MoTPS基因的序列特征及其在生长素IAA处理下的表达模式。本研究利用RT-PCR获得3个巴戟天MoTPS基因的全长c DNA序列,分别命名为MoTPS1、MoTPS2和MoTPS3。基因序列分析显示,基因全长分别为2 841、2 126和2 144 bp,开放阅读框(ORF)分别为2 481、1 668和1 943 bp,分别编码826、555和640个氨基酸。序列分析结果显示,3个MoTPS基因编码蛋白均为亲水性的不稳定蛋白,3个基因的氨基酸序列含有萜类特有的天冬氨酸(DDXXD)富集基序及RXR保守基序,并含有萜类ClassⅠ超级家族结构域。同源比对分析显示3个MoTPS基因氨基酸序列与咖啡树匹配的TPS基因同源性均达到75%以上。系统进化树分析表明MoTPS1基因属于TPS-f亚族分支,而MoTPS2和MoTPS3基因同属于TPS-d亚族分支。启动子克隆得到序列长度为739 bp的MoTPS3基因启动子,其含有多种光响应、激素响应顺式元件,如G-box、Sp1、P-box、TGA-element等。荧光定量PCR分析表明3个MoTPS基因在巴戟天根、茎、叶中稳定表达且具有组织特异性;经生长素IAA处理后,3个MoTPS基因在根中的相对表达量均显著上调。因此研究推测,3个MoTPS基因参与巴戟天根中萜类次生代谢物合成过程且生长素IAA对MoTPS基因的表达调控发挥重要作用。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

玉米Rubisco活化酶基因ZmRCA1的序列变异分析

Rubisco活化酶(RCA)是一种可激活光合作用关键酶Rubisco的伴侣蛋白,可通过对Rubisco的活性调节决定植物的碳同化效率。为了研究玉米ZmRCA1的多态性,本研究参考GenBank中编码玉米Rubisco活化酶的ZmRCA1基因组序列设计引物对玉米微核心种质的95份自交系的ZmRCA1进行测序,获得长约1 680 bp的基因组序列。多态分析表明,在1 680 bp的区间内共发现22个SNP和8个InDel,其中5个SNP和1个InDel变异产生氨基酸序列改变;频率在0.1以上的13个多态性位点共形成27种单倍型,利用6个多态性位点就可以分辨约90%的单倍型。ZmRCA1基因具有高度序列保守性,基因DNA序列相似性为97.9%,而氨基酸序列的相似性则达99.8%;中性检验表明ZmRCA1基因符合中性进化模型假设,没有发生纯化选择。