松墨天牛肌球蛋白轻链2基因的鉴定及表达模式

为阐明松墨天牛肌肉收缩机理和相关基因表达模式,用构建c DNA文库方法,从松墨天牛c DNA中克隆到松墨天牛肌球蛋白轻链2基因,命名为Ma MLC-2(Gen Bank:KM371003)。该基因c DNA为882 bp,其中开放阅读框(ORF)为618 bp,编码205个氨基酸,推测的蛋白等电点为4.66,分子量为22.26 k Da。Ma MLC-2的氨基酸序列与赤拟谷盗同源性最高,为96%,与东方蝼蛄等8种昆虫同源性为85%~88%。松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一分支上。Ma MLC-2属于亲水性氨基酸,存在2个EF-hand结构域,长度均为29个氨基酸,其中第1个EF-hand结构域含有Ca2+结合位点。SWISS-MODEL预测结果显示,Ma MLC-2有2个螺旋-环-螺旋结构。用RT-q PCR分析了Ma MLC-2基因的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量高于成虫;成虫中足表达量最高,腹部表达量最低,各部位均有表达,且有显著差异(P0.05)。     

松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的克隆与表达分析

为阐明松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的结构特点和在不同虫态、成虫的不同部位以及幼虫组织中的表达情况,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆松墨天牛STT3B基因cDNA,命名为MaSTT3B,其Gen Bank登录号为KT362368。序列分析显示其长度为2 552 bp,其中开放阅读框长2 322bp,编码773个氨基酸。MaSTT3B的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高,为93%,在系统发育树的同一个分支上。用实时荧光定量PCR分析MaSTT3B的相对表达量,结果表明:STT3B在蛹中的表达量高于成虫;在成虫足的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的相对表达量最高。     

α—蒎烯防治储粮害虫的室内试验

本试验测定了α-蒎烯对玉米象、杂拟谷盗、谷蠹、赤拟谷盗、锯谷盗等7种主要储粮害虫的实验室防治效果,结果表明:如果浓度高于50ppm,α-蒎烯对7种甲虫有很强的熏杀作用,其作用强度受浓度左右,死亡率随浓度降低而下降.不同甲虫对α-蒎烯的敏感性不同,7种甲虫的敏感性顺序是:长角扁谷盗>锈赤扁谷盗>杂拟谷盗>谷蠹>玉米象>赤拟谷盗>锯谷盗.储粮甲虫的不同虫态对α-蒎烯的敏感性不同,就杂拟谷盗而言,顺序是:成虫>幼虫>卵>蛹.据McDonald方法测定:α-蒎烯对杂拟谷盗成虫有明显的驱避作用.模拟试验结果说明:α-蒎烯在小麦中的杀虫效果比在玉米和大米中要强得多,而在大米中的效果又最差.如果浓度高于50ppm,在小麦中对玉米象和杂拟谷盗有较好的熏杀效果,如果浓度高于100ppm,则效果很理想.在100ppm浓度下,α-蒎烯在玉米中对玉米象和杂拟谷盗有一定的杀虫效果,而在大米中,几乎失去了杀虫作用,这可能是大米对α-蒎烯的吸附较强所致.     

多种昆虫保幼激素对玉米象与赤拟谷盗生物效应的初步筛选

在实验室条件下,对34种昆虫保幼激素衍生物,用玉米象与赤拟谷盗进行药效研究。玉米象对保幼激素敏感性差,50ppm对第二代成虫抑制率90％以上的药剂有6520,Z R512及6515三种。赤拟谷盗较敏感,JH_2,738,ZR515,1ppm即可抑制第二代成虫发生率达90％以上。其次ZR512,ZR513,6515亦在5 ppm有抑制效果。仓库小型试验表明:ZR512,6515与6520在50ppm剂量下,对玉米象、赤拟谷盗与米虱效果较好。保幼激素可阻止赤拟谷盗幼虫生长发育,出现幼虫——蛹及蛹——成虫中间型畸变现象,不能使当代害虫迅速死亡。     

植物芳香油防治仓虫的试验

本试验比较了九种天然植物芳香油和二种芳香油单一成份对杂拟谷盗成虫的熏杀效果,测定了杂拟谷盗、玉米象、谷蠹、锯谷盗、长角扁谷盗、锈赤扁谷盗等六种仓虫对植物芳香油的敏感性,考察了温度、浓度和熏杀时间对杂拟谷盗各虫态死亡率的综合效应。结果表明:1、3、4、11、14号等五种天然植物芳香油对杂拟谷盗成虫的致死效果最好,六种仓虫的敏感性大小顺序是:长角扁谷盗>锈赤局谷盗>杂拟谷盗>谷蠹>锯谷盗>玉米象。在22——32℃范围内,温度对芳香油杀虫作用的影响不明显,从1/10万到1/万,杀虫效果随浓度增加而增加;对不同虫态,以蛹的敏感性最弱,成虫、幼虫都较强,植物芳香油的单一成份α-蒎烯对人畜安全,价格便宜,又能人工合成,是很有生命力的植物性杀虫剂     

电子束辐照对赤拟谷盗保护酶系的影响

研究了赤拟谷盗Tribolium castaneurn（Herbst）不同虫态（3-4龄幼虫、1-2龄蛹和羽化1天成虫）体内过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧歧化酶（SOD）活力在电子束辐照条件下的变化。结果表明,赤拟谷盗不同虫态的POD活力：羽化1 d成虫〉1-2龄蛹〉3-4龄幼虫;CAT活力：羽化1 d成虫〉1-2龄蛹〉3-4龄幼虫;SOD活力：3-4龄幼虫〉1-2龄蛹〉羽化1 d成虫。辐照处理后,保护酶活力随辐照剂量的增加呈先上升后下降的趋势,赤拟谷盗3种虫态POD活力均在500 Gy辐照剂量最高;3-4龄幼虫和1-2龄蛹CAT活力在420 Gy辐照剂量最高,羽化1 d成虫300 Gy最高;3-4龄幼虫和1-2龄蛹SOD活力在420 Gy辐照剂量最高,羽化1 d成虫500 Gy最高。本试验结果有助于阐明电子束辐照对储粮害虫的生理生化效应。     

两种低氧条件对赤拟谷盗不同虫态的抑制作用

研究了在28℃、75%RH的温湿度条件下,5%和2%低氧储藏条件对赤拟谷盗高龄幼虫、蛹和成虫的抑制作用。在5%和2%氧气条件下暴露15d后,赤拟谷盗高龄幼虫化蛹率分别为95.0%和3.7%,蛹羽化率分别为98.0%和0%,成虫死亡率分别为12.7%和100%。本研究结果为气调储粮防治害虫提供依据。     

A STUDY ON STORED GRAIN INSECIS EXPOSED TO DIFFERENT NITROGEN CONCENTRATION AT 25℃

在25℃±1℃,70％±5％R.H.的条件下,研究90％、95％和98％浓度的氮气对储粮害虫的控制效果,结果表明:90％以上氮气对混合虫态发育为成虫以及成虫的生育均有抑制作用,时间越长,抑制效果越好,90％氮气不能用于对害虫成虫的防治;95％氮气对米象、锈赤扁谷盗和书虱成虫有效,但不能有效防治赤拟谷盗和谷蠹成虫,对所有试虫的混合虫态均可以控制,但需要通气的时间较长,对混合虫态的控制效果为依次为:米象＞赤拟谷盗＞锈赤扁谷盗＞谷蠹；98％氮气对所有成虫的控制效果均较好,对混合虫态发育为成虫的控制效果也较好,对成虫的控制效果依次为:米象＞锈赤扁谷盗＞赤拟谷盗＞谷蠹,对混合虫态的控制效果依次为:赤拟谷盗＞锈赤扁谷盗＞米象＞谷蠹.不同浓度氮气对害虫的防治效果与害虫是否具有PH3抗性无关,氮气气调可用于对PH3抗性虫种的防治.     

温、湿度对黑拟谷盗卵孵化率及其发育的影响

黑拟谷盗Tribolium madens(Charp.),是新疆、甘肃、青海、宁夏等地面粉厂害虫,亦能为害小麦的胚乳。国内尚未报道此虫的生物学特性的论文。其卵在17℃以下,22、27、30、35、37、40℃不同温度及相对湿度40％、70％条件下处理后,卵孵化率有明显的差异。可分三个温区:17℃以下及40℃时卵孵化率为O,37℃孵化率为50％左右,其它温度下黑拟谷盗卵有70％以上孵化。从卵期来言,温度低卵期长,温度高卵期短。湿度对卵孵化率无影响。在温度17℃以下及37℃时黑拟谷盗幼虫不能进入蛹期。赤拟谷盗、杂拟谷盗在37℃时却有部分幼虫化蛹。27℃黑拟谷盗、杂拟谷盗幼虫死亡率为10％,赤拟谷盗在20％以下。黑拟谷盗个体幼虫在此温度条件下需要32—40天才能全部化蛹,群聚生活的幼虫二个月内仍处于幼虫期。赤拟谷盗、杂拟谷盗个体与群体幼虫化蛹天数的差异不如黑拟谷盗明显。相对湿度70％,温度范围20—30℃条件下黑拟谷盗幼虫发育随温度升高而加快,幼虫期缩短。黑拟谷盗蛹期在35℃为4.3天,27℃为5.6天,22℃为20天。黑拟谷盗卵孵化卒,幼虫发育仅仅在低湿条件下一个很狭窄的温度范围25—30℃内最佳。卵期、幼虫发育期,蛹期均短。且幼虫具有群聚性而延长幼虫期的特性,从而导致在西北某些地区偶而发现黑拟谷盗成虫的现象。     

赤拟谷盗磷化氢抗性与体内能源物质含量的关系研究

多糖、甘油三酯和可溶性蛋白是昆虫体内主要的三种能源物质.本研究通过乙酰丙酮法、蒽酮比色法和考马斯亮蓝G-250法测定了赤拟谷盗 Tribolium castaneum(Herbst)磷化氢(PH3)抗性品系与敏感品系成虫、蛹和幼虫体内三种能源物质的含量.结果表明,除幼虫体内的甘油三酯和多糖外,其它的测定结果均为敏感品系最高,说明抗性品系赤拟谷盗的能源物质储量可能产生了一定程度的缺失.     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一。本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉‘KK1543’在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO。GhRBCO基因编码区长747 bp,编码249个氨基酸;比对氨基酸序列及同源性分析发现,GhRBCO与其它植物中的RBCO蛋白的一致性较高,表明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树结果显示,GhRBCO与雷蒙德氏棉、亚洲棉和黄花嵩的同源性最高。利用荧光定量PCR技术在15%PEG胁迫下研究该基因表达变化,表达量在棉花的根、茎和叶中都表现为先缓慢升高后降低的变化趋势,在根中表达量在24 h达到第一次最高;在茎中于12 h表达量最低。该基因的表达量在棉花的根、茎、叶中都呈上调表达水平。结果表明,GhRBCO基因可能参与棉花调节非生物胁迫机制。本研究结果为进一步研究GhRBCO基因的功能奠定了一定的基础。     

矮牵牛DFR-A基因的克隆与表达分析

通过分离矮牵牛DFR-A基因,研究其在不同部位的表达规律和酶活性变化,为花色素苷合成的结构基因分离及其他研究奠定基础。基于已公布的矮牵牛DFR序列,直接从矮牵牛花瓣中分离了DFRA基因序列,利用实时荧光定量PCR技术研究其在不同器官中的表达特性,同时测定了不同器官中的DFR酶活性。（1）矮牵牛DFR-A基因cDNA序列为1473 bp,该基因最大开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸。（2）DFR-A基因在矮牵牛各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在花药中的表达量最高,其次是初开和盛开花瓣中,各期花蕾中的表达量都较低,而在叶中表达量最低。（3）DFR酶在叶片及花药中几乎无活性。在初开花瓣中达到最高峰。（4）除花药以外的部位,DFR酶活性与DFR mRNA浓度存在线性相关性。矮牵牛DFR酶活性主要受转录调控,活性在初开花瓣中最高。     

陆地棉水通道蛋白GhNIP6.1基因的克隆及表达分析

根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR技术,从陆地棉品种苏棉18中克隆获得了一个水通道蛋白基因GhNIP6.1。该基因开放阅读框包含903个核苷酸,编码300个氨基酸,分子量为30.97kD,理论等电点为8.99。GhNIP6.1蛋白的生物信息学分析表明:GhNIP6.1含有6个跨膜区,由5个环相连,其中环A、C和E在细胞膜外,环B、D和蛋白的N、C末端都位于细胞膜内,N末端79个氨基酸,C末端18个氨基酸,具有MIP家族典型的保守氨基酸序列;该蛋白的三级结构同拟南芥的AtNIP6.1非常相似,亚细胞定位也同AtNIP6.1一致,可能位于质膜中。进化分析发现,GhNIP6.1蛋白同拟南芥的AtNIP6.1蛋白相似性最高。进一步扩增棉花核基因组获得了2021bp的DNA序列,它包含5个外显子和4个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则。半定量分析表明,该基因在根、茎和叶中都有表达,其中真叶含量较高,子叶中没有表达。     

荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是植物黄酮合成途径的关键酶,为了研究鲜切荸荠贮藏过程中表面黄化的机理,利用RACE技术对荸荠CHI基因编码区cDNA全长进行克隆,并分析其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达。结果表明,荸荠CHI基因(CwCHI)cDNA序列长度为1 003 bp(GeneBank:MG719238),含有一个744 bp的最大开放阅读框,其DNA包含3个内含子和4个外显子。Cw CHI可编码247个氨基酸,经预测其分子量为26.410 kD,理论等电点为4.89。Cw CHI蛋白的二级结构以α-螺旋为主,占38.06%。通过多重比对发现,CwCHI具有该家族特有的保守结构域,决定底物偏好性的第201位氨基酸为Ser,与其他Ⅰ型CHI蛋白相同。系统进化分析表明CwCHI与油棕榈和菠萝的CHI蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwCHI基因在荸荠皮中的表达量最高,而在荸荠肉中的表达最低。鲜切荸荠黄化过程中CHI活性和CwCHI表达量快速上升,水杨酸处理抑制了CHI活性的上升和CwCHI的表达。     

蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫响应的分子调控机理,本研究采用RT-PCR及RACE的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个C3型PEPC基因PhPEPC (登录号为:MK482383),该基因cDNA全长序列为3 448 bp,开放阅读框长度为2 898 bp,编码965个氨基酸;该蛋白包含一个PEPC酶结构域,具有2个PEPCase活性位点,86个磷酸化位点和7种motifs,为一酸性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhPEPC蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、深圳拟兰等的PEPC蛋白亲缘关系最近。分析表明,PhPEPC基因在蝴蝶兰根中表达水平最高,在花器官中的表达水平次之,在叶和花梗中的表达水平最低;在13℃/8℃的昼/夜温度条件下,PhPEPC基因的表达水平先升高后降低,当恢复培养3 d时,该基因的表达水平又趋于升高。结果表明,蝴蝶兰PhPEPC基因参与了对低温胁迫的调控。本研究结果将有助于理解蝴蝶兰对低温胁迫的适应机制,并为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供依据。     

赤拟谷盗乙酰胆碱酯酶生化及毒理学特性研究

为了阐明赤拟谷盗[Tribolium castaneum (Herbst)]体内乙酰胆碱酯酶(AChE)在其各虫态间的变化关系,以期为该虫的综合治理提供一定的理论依据,本试验采用微量滴度酶标板法,分别对其10d龄和20d龄幼虫、蛹及成虫体内AChE的生化及毒理学特性进行了较为系统的研究。结果表明,赤拟谷盗各虫态AChE酶源蛋白含量、酶活力和比活力差异显著,酶源蛋白含量从低到高依次为：10d龄幼虫<20d龄幼虫<成虫<蛹;AChE活力和比活力依次为：成虫<蛹<10d龄幼虫<20d龄幼虫。酶动力学分析发现,AChE米氏常数Km值大小依次为：蛹<成虫<10d龄幼虫<20d龄幼虫,但成虫和蛹之间的差异不显著。此外,幼虫AChE的最大反应速度Vmax亦显著高于成虫和蛹。通过对幼虫AChE离体抑制作用测定表明,毒扁豆碱、马拉氧磷和西维因对20d龄幼虫的抑制中浓度I50均高于10d龄幼虫,说明20d龄幼虫体内的AChE对3种抑制剂的抑制作用更不敏感。     

松材线虫Bx-Daf-22基因鉴定及表达

[目的]为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)抗逆态幼虫DL3(Dauer larvae3)形成的分子机理,对其鸟苷酸环化酶路径(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)中的抗逆态基因daf-22进行了鉴定和表达研究。[方法]根据松材线虫基因组数据设计引物克隆松材线虫Bx-Daf-22基因。进一步对Bx-Daf-22基因编码的蛋白进行系统发育分析、保守结构域分析等生物信息学分析。应用BLAST比对技术在松材线虫基因组数据中鉴定得到固醇载体蛋白SCP2同源基因,命名为Bx-Daf-22。应用PCR技术扩增Bx-Daf-22完整蛋白编码区,分析同源序列系统进化和三维结构。[结果]结果表明,Daf-22作为路径的起点是cGMP路径中一个受体蛋白,可将起始信号传递到cGMP路径的膜结合受体上,再通过胰岛素相似信号途径(insulin like signaling,Insulin/IGF)中的β-胰岛素(β-insulin,Daf-28)以及转化生长因子β路径(transforming growth factor β,TGFβ-like)中的热激蛋白90(HSP90/Daf-21)连接从而调控线虫进入抗逆态。[结论]通过结构比对及基因表达量分析表明Bx-Daf-22与秀丽线虫Daf-22具有相近的功能。Bx-Daf-22编码的蛋白质具有固醇载体蛋白SCP2构域。因此松材线虫的cGMP路径与DL3形成具有直接相关。