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1.
为阐明大丽轮枝菌微菌核形成发育的分子机理,利用农杆菌介导的遗传转化方法,建立了包含2 000个转化子的大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突变体库,并在查氏、查氏-根或PDA培养基上培养,观察各转化子的菌落形态。从中筛选出130个菌落特征与野生型菌株V08DF1有明显差异的突变体菌株,其中14个突变体菌株为微菌核发育受阻。对这14个微菌核发育异常的突变体菌株进行T-DNA插入的PCR验证,均能扩增到潮霉素抗性基因,Southern杂交显示其中7个为单拷贝插入,5个为双拷贝插入,2个为三拷贝插入,表明T-DNA已经成功整合到这些突变株的基因组DNA中。 相似文献
2.
利用农杆菌介导遗传转化(ATMT)的方法,成功构建含2 000个转化子的棉花黄萎病菌强毒菌株Vd080的突变体库。200μmol/L乙酰丁香酮(AS)作诱导剂,25℃共培养48h,棉花黄萎病菌孢子量为106 mL-1,其转化效率达150~540个转化子。进一步研究发现,供试突变体的T-DNA成功插入Vd080基因组,且均为单拷贝插入,转化子的潮霉素B基因能够稳定遗传。309个突变体中,53.7%的突变体菌落形态与初始菌株Vd080相同,均产生黑色的微菌核,不产生黑色素微菌核的菌丝型仅占17.5%。与初始菌株相比,随机选取的85个突变体,产孢量、生长速率、粗毒素分泌量及致病力发生显著变异的菌株分别占36.4%、12.9%、50.6%和29.4%,四者之间不存在明显的相关性。 相似文献
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利用农杆菌介导转化的方法共得到1 114个稻瘟病菌转化子,经感病大麦和水稻离体叶片接种鉴定获得3个致病缺陷或下降突变体:A1-134、A1-452、和A2-1-8,其中A1-134和A1-452的致病性下降,而A2-1-8突变体的致病性丧失.对这些突变体的分生孢子形态、产孢、附着胞形成等表型分析的结果发现,A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株Guy11的7.7,分生孢子为圆球形,无隔膜或只有一个隔膜;A1-452产孢量明显增多,为Guy11的22倍;A2-1-8的分生孢子为长针形,产孢量略有下降;A1-134和A1-452在疏水表面的附着胞形成率与Guy11相近,而A2-1-8则不能形成附着胞.研究结果为进一步鉴定和分离这些突变体的T-DNA标记基因奠定了基础. 相似文献
4.
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的柱花草炭疽病是热带牧草柱花草的主要病害,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)的T-DNA插入突变技术,可使炭疽病菌基因组上被插入部位的基因丧失功能,是研究柱花草炭疽病菌致病机理的重要方法.在先前优化根癌农杆菌介导柱花草炭疽病菌遗传转化体系的基础上,构建了4 616个转化子的突变体库,从中随机选取部分突变体,对其T-DNA插入拷贝数、遗传稳定性、生长速度、产孢量、分生孢子萌发等进行分析.结果表明,所得转化子多为单拷贝,能稳定遗传.一些转化子的生长速度、产孢量、分生孢子萌发率与野生型相比有明显差异. 相似文献
5.
插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系 总被引:9,自引:0,他引:9
通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低 相似文献
6.
采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。 相似文献
7.
开展植物提取物对层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)的抑制活性研究,为其防治奠定理论基础,采用菌丝生长速率法测定药用植物水提物对层出镰刀菌的抑制及毒力作用。结果表明:黄连等15种药用植物提取物对层出镰刀菌菌丝生长有一定的抑制作用,当药用植物水提物浓度为20 mg干样/mL时,其抑菌率为0.24%~77.17%,其中以黄连的抑制效果最佳,黄连水提物对层出镰刀菌的毒力回归方程的EC50值为1.063 0 mg干样/mL。黄连水提物在防治层出镰刀菌方面具有的良好应用潜力。 相似文献
8.
以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2 000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。 相似文献
9.
镰刀菌引致的百香果病害研究 总被引:1,自引:0,他引:1
《仲恺农业工程学院学报》2019,(4)
百香果(Passiflora edulia)是热带和亚热带地区水果,近年来在我国南方地区种植面积快速增加,同时病害发生也非常严重.从百香果病株叶片、果实和茎基部均可以分离得到镰刀菌(Fusarium sp.),经致病性测定、形态学特征和分子生物学方法进行病原菌研究,明确了导致百香果叶片发病的病原菌为藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、导致果实和茎基部发病的病原菌为轮纹镰刀菌(Fusarium concentricum).镰刀菌可引致百香果(P.edulia)叶片、果实和茎基部发病,研究结果为百香果病害防治提供了理论依据. 相似文献
10.
尖孢镰刀菌西瓜专化型遗传转化体系的优化 总被引:4,自引:0,他引:4
以尖镰孢霉西瓜专化型[Fusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.niveum(E.F.Smith)Snyder et Hansen]为试材,以农杆菌[Agrobacterium tumefaciens(Smith & Townsend)Conn=Rhizobium radiobacter(Beijerincket van Delden)Yonng et al]的T-DNA为介导,将抗潮霉素基因插入西瓜枯萎病菌基因组中,对遗传转化体系进行优化,并对5个突变体菌株和野生型镰刀菌的最适生长温度和培养基进行筛选.结果发现,乙酰丁香酮(AS)浓度为300~400μmol/L,农杆菌OD660为0.1~0.2,野生型镰刀菌分生孢子浓度为(0.1~5.0)×106个/mL时,转化效率最高,约为500个转化子/106个分生孢子;F3181、F3280、F2192、F2195、F3179突变菌株的最适生长温度为25~28℃. 相似文献
11.
层出镰孢菌原生质体制备条件的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据. 相似文献
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层出镰孢高效杀菌剂筛选及田间防效 总被引:1,自引:0,他引:1
玉米鞘腐病是玉米上的一种重要鞘部病害,其病原主要为层出镰孢。为筛选该病的有效防治药剂,本研究选取9种杀菌剂进行了室内毒力测定,并对效果较好的药剂进行了田间防治试验。结果表明:苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、苯甲·嘧菌酯、咪鲜胺、硅唑·咪鲜胺对层出镰孢均有一定的抑制效果,其中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咪鲜胺和硅唑·咪鲜胺对层出镰孢具有较好的防治效果,其EC50值分别为2.16,1.59,0.01,0.01mg/L;对孢子萌发的抑制率分别为6.57%,9.09%,59.09%,58.08%;田间防效分别达55.72%,62.54%,52.32%和45.51%,挽回玉米产量损失率分别为2.61%,0.39%,8.45%,10.15%。综合上述结果可知,上述4种杀菌剂对玉米鞘腐病防效显著,可作为防治该病的备选药剂。 相似文献
13.
针对花器官形态和种子发育突变表型对大型水稻T-DNA插入突变体库进行筛选,获得了大量突变体信息及材料,在9 760个突变体家系中筛选得到177个花器官形态和数量异常的突变家系,突变频率为1.81%;对9 760个家系中的3 432个家系筛选得到179个种子发育缺陷的突变家系,突变频率为5.22%。对所获得的270个突变家系进行了T-DNA插入的阳性检测,阳性率为64.8%。利用公共数据库RMD(Rice MutantDatabase,RMD)给定的侧翼序列,鉴定了其中1个结实率较低的突变体家系,表明其突变表型和T-DNA插入共分离,为深入研究该基因的功能提供了重要的遗传材料。 相似文献
14.
【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL -1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL -1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。 相似文献
15.
【目的】通过农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量(试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度)试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为:农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。 相似文献
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The effects of solarisation using clear, UV stabilized, 25μm low density polyethylene mulching combined with soil amendment of chicken manures 12 th^-1, mixed fungicides of Metalaxyl 2 g-Benlate 1.5 g L^-l, Biocontrol agent of Trichoderma harzianum (T.h.) and NPK fertilizer 180 Kg h^-1, on the survived micro and macrocondia of Fusarium proliferatum (Matsushita) Nirenberg were ascertained during summer 2008. Mulched treatments within 45 and 60 days significantly reduced viable propagules to 6 and 3.4 × l03 cfu1 g soil, respectively at 5 cm depth followed by 15 and 30 cm soil depth. Natural heating of dry soil reduced an initial population of 76 × 10^3 to 46.73, 49 and 49.13 × 103 cfu'lg soil at 5, 15 and 30 cm depth, respectively. Therefore, Fusarium proliferatum reduced by 85.29 and 89.22% within 45 and 60 days compared to 38% in control aired soil. Application of mulching with T. harzianum caused a worthwhile reduction 84.37% in viable propagules, solar with low doses of Metalaxyl-Benlate further reduced Fusarium propagules at all depths 95.5%. Combining chicken manures proved its reduction of fungi cfu at 5 cm depth only, whereas NPK amendments failed in their reduction effects at various depths. However, almost 95% reduction in Fusarium propagules was achieved at various soil depths when combining Met.-Ben., with soil mulching. Combining T.h. was also proved to be significant in reducing fungus inoculum by 88.58, 96.06% at 5 and 15 cm depth. Generally, manures and NPK fertilizers amended soil found equally effective in reducing cfu of Fusarium at 5 and 15 cm depth similar to polyethylene mulching for both solar duration. 相似文献
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病原菌和植物相互作用时分泌效应蛋白(effectors)抑制植物的防卫反应。枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌病害,尖孢镰刀菌和寄主相互作用时分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白(15.8~29.9 kD)进入木质部启动致病力,称为SIX(secreted in xylem)蛋白,其中,SIX6蛋白是一个效应蛋白。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp.Niveurn,Fon)引起的真菌病害。为了明确FonSIX6在侵染西瓜时的作用,克隆了该基因的上下游序列,以潮霉素为筛选标记构建了该基因的缺失突变体载体pDH\|SIX6;将构建好的基因缺失载体转入农杆菌AGL\|1中,通过农杆菌介导的遗传转化和转化子的筛选获得了FonSIX6基因的缺失突变体。 相似文献
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为了优化高效拮抗生防菌哈茨木霉T2-16的EMS诱变条件,构建哈茨木霉T2-16突变体库,为哈茨木霉功能基因组研究奠定材料基础,以哈茨木霉T2-16为试验材料,采用单因素试验以0~0.6 mol·L-1 EMS溶液分别处理不同浓度孢子0~6 h,明确适于哈茨木霉诱变的EMS最佳浓度、处理时间和孢子浓度。以最适参数诱变处理野生型菌株,进行生长势、拮抗能力和生防效果比较。结果显示,0.4 mol·L-1 EMS溶液处理浓度为106 ·mL-1的孢子4 h,其致死率接近70%,诱变效果最佳。经生长势、拮抗能力和生防效果比较发现,生长势呈正向突变占有率达46.20%,其中,16株突变菌株拮抗作用明显增强,T42和T62的生防效果分别高出野生型菌株31.64%和27.91%,为研究哈茨木霉与生防相关的功能基因打下基础。 相似文献
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尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库.利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11,获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株.随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选,结果表明所有植株均呈抗性,并且与PER检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假转化体.Southern blot分析结果表明T0植株大部分为单位点整合.T0及T1代转化植株均呈现了一些形态变异,如矮化、无分蘖或多分蘖、结实率降低、粒型或穗型改变、小穗结构改变等.利用Hm离体叶片筛选法对部分T1群体进行筛选,得到了1个变异性状与Hm抗性共分离的突变体,该突变体的变异表型为结实率比非转化对照下降约50%,每穗颖花总数比对照减少约40%,二者的总效应导致突变体单穗产量比对照约下降70%. 相似文献