新型鸭呼肠孤病毒σC基因原核表达及其抗原性的初步研究

应用原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒σC基因,分析σC蛋白的抗原性。根据已登录的新型鸭呼肠孤病毒（NDRV） NP03株S1基因序列,针对σC基因设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR扩增该基因,并将此片段克隆到原核表达载体 pET-30a （＋）上,将序列正确的重组质粒命名为 pET-NDRV-σC ,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,1.0 mmol·L -1 IPTG 37℃诱导表达。结果显示,RT-PCR扩增得到966 bp的目的片段;表达产物经 SDS-PAGE分析,获得了与预期相符的约41.3 ku的条带,重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting 分析显示,重组蛋白能与 NDRV 阳性血清发生反应。本试验首次应用原核表达系统获得NDRV σC蛋白,并证明其具有免疫反应性。     

新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT\|PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到pET\|28a（+）原核表达载体,获得重组质粒pET\|28a（+）\|σC。将重组阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达后经SDS\|PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 kDa。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。     

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了解新型鸭呼肠孤病毒(NDRV TH11株)σC蛋白的抗原性,采用RT-PCR方法扩增了NDRV TH11株σC蛋白的编码基因,将其克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-σC重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明该重组蛋白获得高效表达,并具有较好的反应原性。以纯化的σC蛋白免疫实验兔制备了抗σC蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别NDRV的σC蛋白,显示出σC蛋白具有良好的免疫原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白（N）基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T．1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31（DE3）感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39．866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10％的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。     

环加氧酶2基因的大肠杆菌表达与纯化

通过RT-PCR从肺癌细胞株A549克隆环氧化酶2（cyclooxygenase2,COX-2）基因全长1．8kb,测序结果与已发表的一致;将该片段插入pET32-a（＋）载体中,构建原核表达载体pET-32-COX-2,转入BL-21中,IPTG诱导重组融合蛋白his—COX-2表达,SDS-PAGE分析71kD处有特异条带,与理论相符;Western blotting验证为COX-2蛋白;用镍离子螯合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白,获得纯度较高的原核表达蛋白．为其新型抑制剂的研发与抗肿瘤作用蛋白疫苗的研制奠定基础．     

传染性法氏囊病病毒VP5蛋白跨膜区的敲除及可溶性原核表达研究

[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。[方法]利用PCR技术分别扩增IBDVVP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b（＋）同时相接,即载体一胞内片段一胞外片段一载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET—VP5-FC及改进后的pET—VP5-SC。将表达质粒转化BL21（DE3）,IPrG诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白。[结果]得到可溶性表达的IBDVVP5。[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础。     

截短NDV F蛋白的原核表达

根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR方法从猪肾脏皮质组织中扩增出pEGF基因，将其连接到克隆载体pMD18-T上，经测序鉴定正确后，再克隆到原核表达载体pET-41a（＋）上，构建重组表达质粒pET-EGF．用重组质粒转化Ecoli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳和Western-blotting对GST—EGF融合蛋白进行分析，结果表明37℃诱导表达的融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的20．2％；30℃诱导表达的可溶性融合蛋白含量较高，占菌体总蛋白的7．7％．     

可溶性Sox2-11R重组蛋白的制备与鉴定

旨在通过原核表达制备可溶性Sox2-11R重组蛋白,并验证其穿膜能力。首先,采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)与蛋白转导域11聚精氨酸（11 arginine, 11R）的融合表达和与成纤维细胞的共孵育验证11R的穿膜能力。其次,将目的基因Sox2-11R在原核表达载体pET30a中表达,通过优化表达条件获取可溶性Sox2-11R重组蛋白。最后,利用Ni柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定;并用免疫荧光染色验证重组蛋白是否具有进入细胞核的能力。结果表明,成功构建了pET30a-Sox2-11R原核表达载体,纯化的Sox2-11R重组蛋白具有穿膜能力,且在细胞培养基中具有较高溶解度,这为制备其他重编程因子的重组蛋白提供了参考,也为外源蛋白诱导iPSCs奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σNS和σC基因shRNA载体构建及其干扰效果测定

禽呼肠孤病毒σC基因是病毒粘附蛋白,σNS基因具有结合单链RNA活性。根据siRNA靶序列设计原则,设计并合成siRNA模板并克隆到shRNA表达载体pSilencer-CMV 4.1 neo。分别构建了针对σC基因的shRNA载体C1、C2、C3和针对σNS基因的shRNA载体NS1、NS2、NS3。将构建的shRNA载体和阴性对照分别与表达σC和σNS基因的融合蛋白的真核表达载体pEGFP-σC及pEGFP-σNS共转染DF-1细胞。荧光显微镜观察结果表明,6个shRNA片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Real-time PCR检测结果表明,C3和NS1体外干扰病毒复制的效果最佳。     

不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别，并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、p GEX-4T-1、p ET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，利用镍-氨三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白，并用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示，p Cold-TF载体以表达可溶性蛋白为主，pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白，而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示，可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白（P<0.05）。p Cold-TF载体的触发因子（trigger factor, TF）标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达，其表达蛋白的免...     

桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH结合区蛋白的原核表达、纯化及复性

为了剖析桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH蛋白的结合活性,从桃果实中提取总RNA,采用RT-PCR方法,以桃果实RNA逆转录的cDNA为模板,扩增出ABAR/CHLH基因的结合区功能片段C369,回收目的片段并测序,基因片段长度为1 121 bp,编码369个氨基酸残基,分子量约为40 kD。利用BamHⅠ和NotI酶切位点将该片段编码区插入原核表达载体pET-28a（＋）中,构建ABAR/CHLH基因片段原核表达载体pET28a-C369,经菌落PCR和测序确证后,转化E.coliRosetta（DE3）,通过IPTG诱导其表达His-CHLH融合蛋白。通过SDS-PAGE检测及Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,并用纯化复性的His-CHLH C369融合蛋白制备抗体。     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

水稻Os SSI2基因负调控水稻的抗病反应,为了研究该基因的抗性机理,构建p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件,使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明:成功构建了p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体后进行原核表达,在IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为25℃,诱导表达7 h,通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现Os SSI2蛋白的可溶性表达量最多,为进一步研究水稻Os SSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因（MaNPC1）开放阅读框（ORF）进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C₂₇₄₇H₄₂₄₉N₇₆₉O₇₉₃S₁₀,分子量为61.06 k D,理论等电点（pI）为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Western blotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏3~15 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。     

GAPC2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究采用PCR法以拟南芥cDNA为模板扩增GAPC2基因片段,克隆至原核表达载体PET28a（＋）上,经0．25、0．5mMIPTG分别在37℃和20℃诱导后,再使用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达水平。结果表明：原核表达载体PET28a（＋）-GAPC2构建正确,并且能在大肠杆菌BL21中成功表达,其融合蛋白分子量为37KD。     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达．     

莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体（Borrelia burgdorferi）端粒解离酶（telomere resolvase,ResT）进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28-b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、BL21 Gold(DE3) pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3) pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体 ResT（W94H）进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT（W94H）与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种（seeding）和交叉接种（cross-seeding）方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3) pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度（95%）且高质量浓度（15 mg/mL）的ResT（W94H）,其能够与底物DNA形成稳定的ResT DNA复合物。在18 ℃下,ResT DNA最佳结晶条件是：PEG3350 150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L（pH 6.6）、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52 ?,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT (W94H）蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。