猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

猪瘟病毒E2基因的克隆与鉴定

根据猪瘟病毒Brescia株全基因序列设计合成特异性引物对P1/P2对，采用异硫氰酸胍一步法（略加修改），从PK15细胞培养物中提取石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株猪瘟病毒的总RNA。应用RT-PCR方法成功地扩增出E2全基因组约1273bp的cDNA片断，经电泳证明其大小与推测相符。分别将石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株的E2基因片段克隆到pGEM-T载体质粒，通过对这4个重组质粒的EcoRI酶切鉴定、直接与套式PCR扩增，并对E2主要抗原区域进行224bp的序列测定，表明E2全基因克隆成功，为E2全序列测定和结构与功能的分析奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达及Dot-ELISA建立研究

为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。     

猪瘟病毒石门株E2基因的RT-PCR克隆及鉴定

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株Ｅ２基因,大小为１１８４ｂｐ,与预期大小一致。经巢式ＰＣＲ和酶切鉴定证实所扩增的片段为Ｅ２基因特异性片段。将扩增的Ｅ２基因克隆到Ｐ＾ＧＥＭ－Ｔ载体,采用限制性内切酶鉴定和ＰＣＲ技术了阳性重组子。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

根据已发表的猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）Shimen株的全基因组序列，设计2对引物P1／P2和B1／B2，在B1和B2的5’端分别加上EcoR 1和BamH 1位点，以CSFV—Shimen株脾毒为材料。一步法提取总RNA。并以此为模板采用反转录PCR（RT—PCR）和套式PCR（nPCR）。成功地扩增出约1．2kb的E2基因。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化。经PCR和酶切鉴定获得重组质粒E2-T。将E2-T经EeoR 1和BamH 1酶切消化、回收目的基因后。与经BamH 1／EcoR 1酶切的逆转录病毒载体pBABE—puro连接并转化，经酶切鉴定获得重组质粒pBABE—puro—E2。序列测定表明，目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白,并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性,为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段,运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体,构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清,通过间接ELISA方法测定抗体水平,间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示,37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下,E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达,经纯化复性后免疫小鼠,制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白,制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

猪瘟病毒石门株基因组cDNA片断的扩增与克隆测序

以猪瘟病毒（ＨＣＶ）中国石门株强毒的血毒、细胞毒及Ｃ系兔化弱毒的细胞毒中提取的总ＲＮＡ为模板，应用逆转录─聚合酶链式反应（ＲＴ一ＰＣＲ），在合成的两对ＨＣＶ特异引物引导下，扩增出与预计大小一致的４４１和３００ｂｐ两个核酸片断。寡核苷酸探针杂交证实确为ＨＣＶＰ_８０和ｇｐ４４／４８蛋白编码区特异性的ｃＤＮＡ片断。扩增片断克隆入ｐＵＣ_１９和ｐＢＳＫ（＋）中，并对ＨＣＶ石门株Ｐ_８０区ｃＤＮＡ片断进行测序分析，其与国外Ａｌｆｏｒｔ、Ｂｒｅｓｃｉａ株同源性分别为９０．６％和９４．６％。氨基酸水平上同源性高达９８．４％。为抗猪瘟病毒Ｐ_８０区核酶的设计和应用提供了依据。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

转移抗猪瘟病毒核酶基因兔的研究

采用显微注射法，将构建的绵羊金属疏因（ｏＭＴ）基因启动子与抗猪瘟病毒核酶（ＨＣＶ－Ｒｉｂｏｚｙｍｅ．ＨＲ）基因融合的质粒ｐＭＨＲ＿（３２）线性ＤＮＡ分子约２００～４００个基因拷贝导入兔原核胚的雄原核中，１５９枚导入基因胚移植给９只受体兔，产仔２２只，移植成活率为１３．８％。２２只仔兔经聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和核酸探针杂交检测，６只体内整合有外源目的基因，整合率为２７．３％。再用１００个半数反应量（ＲＩＤ＿（５０））的猪瘟病毒Ｃ系兔化弱毒兔体攻毒，４只外源基因整合的实验兔能完全或部分抵抗ＨＣＶ弱毒攻击，不产生或无明显发热反应；而对照兔和６只ＨＲ基因未整合的实验兔不能抵抗ＨＣＶ弱毒攻击，出现特征性的稽留热型。逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＲＮＡ探针杂交检测４只转基因兔，两只肝中表达出ｏＭＴ－ＨＲｍＲＮＡ。认为微注射导入的外源ＨＲ基因在兔体内得到了整合和表达     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

牛生长激素释放因子类似物基因的克隆与表达

本研究以近期报道的高生物学活性、高代谢稳定性的牛生长激素释放因子类似（Ｉｌｅ＾２,Ａｌａ＾１５,Ｌｅｕ＾２７）ｂＧＲＦ（１－２９）－ＮＨ２的氨基酸序列为模板,选用大肠杆菌高效表达所偏爱的密码子设计出该基因的全序列。采用化学合成法合成两个３’末端有１９碱基互补的８０碱基的寡核苷酸片段。并互为模板和引物,通过酶促延伸合成完整的ｂＧＲＦ类似物基因,克隆于ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ中,通过蓝／白筛     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验监测猪瘟抗体发现隐性猪瘟

用单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验监测瘟血清抗体。测得该场母猪４０份血清样品中，猪瘟弱毒抗体效价ＯＤ值较高，有１００％保护率，测得仔猛进４０份血清样品中，猪瘟弱毒抗体效价ＯＤ值适中，有８７．６％的保护率。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。     

马泰勒虫新疆株EMA2基因的克隆及原核表达

裂殖子表面抗原蛋白家族因其高抗原保守性常作为马泰勒虫ELISA检测方法的基质。本研究根据马泰勒虫EMA2基因序列合成引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板,扩增获得目的基因,将其连接至pEASY-E1载体构建重组质粒pEASY-E-TE,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组EMA2蛋白并鉴定。结果显示:PCR扩增获得了约819bp特异性DNA片段,构建了pEASY-E-TE重组质粒,成功诱导表达了35kDa的可溶性目的蛋白;经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白rEMA2具有良好的抗原性。本试验克隆表达的重组蛋白rEMA2可为ELISA方法的建立及后期研究提供靶基因材料。