海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种：由番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63％,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系：HN-PRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。     

番木瓜畸形花叶病毒hc-pro基因保守基序FRNK点突变对病症表现的影响

为研究番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）hc-pro基因保守基序FRNK对病症表现的影响,本研究采用定点突变的方法,获得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）的突变体克隆p35SPLDMV-GFP-R183/I,该位点突变显著减轻了PLDMV在番木瓜上的病症表现,表明是影响其致病性的关键位点。本研究结果为利用交叉保护防控番木瓜畸形花叶病毒病提供了重要参考和材料。      

转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响，以组织培养的日升番木瓜为研究对象，以β-actin基因为内参基因，应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析，建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系，研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明，0.2 %的禾生素及4.0 g/L和1.0 g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达，而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的     

转基因番木瓜55-1品系的环介导等温扩增检测方法的建立

根据55-1的品系特异性序列设计了5套LAMP引物,筛选扩增效率高的引物。对筛选到的LAMP引物的反应温度和反应体系进行了优化,并进行了特异性、灵敏度和稳定性的实验。结果表明,该套LAMP引物的特异性和稳定性良好,灵敏度为0.05%,最快能在30 min内得到检测结果。建立的LAMP检测方法能有效地检测转基因番木瓜55-1品系,既简化了检测步骤,又缩短了检测时间,为转基因番木瓜的快速检测提供了技术支撑。      

PRSV-CP转基因番木瓜表达与抗病能力关系的研究

利用ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ（点杂交）和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ（分子杂交）等技术，分析了ＰＲＳＶ－ＣＰ转基因番木瓜转录水平（ｍＲＮＡ）的表达，再通过ＲＮＡ斑点杂交和间接斑点ＥＬＩＳＡ等技术估测了ＲＮＡ、蛋白质在ＰＲＳＶ－ＣＰ转基因番木瓜中的表达量，最后通过大田攻毒试验检测了ＲＮＡ、蛋白质的表达量与抗病能力的关系。     

番木瓜果实中芥子酶基因组织差异表达和酶活性研究

检测了番木瓜果实3个发育时期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的果皮(外果皮)、果肉(内果皮)及种子中芥子酶的活性,并通过RT-PCR分析CpTGG1、CpTGG2和 CpTGG3三个番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实各组织的差异性表达情况。结果表明,番木瓜果皮及种子中均有明显的芥子酶活性,但在果肉中无法检测出芥子酶活性;成熟后(Ⅲ期)番木瓜果皮的芥子酶活性相比未成熟前提高了6.6倍,而不同发育时期种子中的芥子酶并不表现出显著差异性。RT-PCR分析结果表明,番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实中的表达存在显著时空差异性。其中,CpTGG1在番木瓜果皮及种子中均有表达,且表达量无明显差异,在果肉中完全无表达;CpTGG2在番木瓜果实的各个组织中均无表达;CpTGG3在果皮及种子中也均有表达,成熟果皮(Ⅲ期)和Ⅰ期种子中表达量比较强,并随着果实的发育成熟而呈现梯度变化。     

PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。     

侵染我国甘蔗的病毒病种类及检测、防治研究进展

介绍为害我国甘蔗的主要病毒病种类及为害特点,并对甘蔗病毒病的检测技术及防治方法进行综述,提出我省甘蔗病毒病研究中存在问题及解决方法。     

利用ID-ELISA技术调查分析海南3种主要番木瓜病毒分布及感病情况

利用PCR方法分别扩增番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）、番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）和番木瓜花叶病（papaya mosaic virus,PaMV）的外壳蛋白（coat protein,CP）基因,并连接到原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET28-PRSV-CP、pET28-PLDMV-CP和pET28-PaMV-CP,通过转化、诱导表达后,经SDS-PAGE分析显示,这3种CP蛋白在大肠杆菌中高效表达,其中PRSV CP蛋白和PLDMV CP以包涵体形式存在,PaMV CP以可溶蛋白形式存在。利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化获得了3种病毒的重组CP蛋白,并免疫大白兔获得高效价的抗体。Western blot检测结果表明,这3种抗血清与对应的诱导表达蛋白发生特异反应。再采用抗血清建立一种快捷、简便和低成本的ID-ELISA（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay）技术,并利用此技术对海南岛283个疑似感病的番木瓜样品进行检测鉴别,初步掌握了海南岛3种主要番木瓜病毒的分布及感病情况,为下一步该病的有效防治策略提供科学依据。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

番木瓜畸型花叶病毒(PLDMV)调查鉴定

对采自广州、景洪（云南）、海口（海南）的各１７,２４,１３个番木瓜样品进行ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和生物测定等分析鉴定,发现来自广州和海口的样品中有２１个样品感染番木瓜环斑病毒（ＰＲＳＶ）,而来自景洪的样品中未发现感染ＰＲＳＶ,在所有样品中都未发现感染有番木瓜畸型花叶病毒的。      

缓释肥料对番木瓜生长发育及果实性状的影响

在盆栽试验下,研究缓释肥料对番木瓜生长发育及果实性状的影响。结果表明,施肥明显促进番木瓜植株的生长发育,改善了果实的物理性状和品质,其中缓释肥料(SRF-3和SRF-4)的效果优于复合肥(CPF)。施肥处理间,可滴定酸含量差异不显著,果横径、果纵径、单果重、产量、全糖和Vc含量差异显著。SRF-3和SRF-4处理间的结果数、果肉厚度差异不显著,但SRF-3、SRF-4与CPF处理之间的差异显著。CPF和SRF-3处理间的固形物含量差异不显著,与SRF-4处理间的差异显著。缓释肥料对番木瓜生长发育及果实性状的影响以每株施用150 g SRF-4的效果最好。     

施肥对番木瓜植株叶柄养分含量的影响

采用L18(37)正交设计,探讨氮、磷、钾、镁、硼肥配施对EksokaⅡ品种番木瓜(Carica papaya Linnaeus)植株叶柄养分含量的影响.结果表明:施氮肥对植株叶柄含氮量的影响最大,其次为施磷、钾和硼肥.施镁肥则影响最小;施氮肥能明显提高叶柄中的含氮量,但当施氮量达35g/株·次时,效果不显著;施磷、钾肥有降低叶柄中含氮量的趋势.施磷肥对植株叶柄含磷量的影响最大,其次为施镁和钾肥,施硼和氮肥的影响最小,磷肥、硼肥施用量与叶柄中含磷量之间无明显的变化规律.施钾和镁肥对植株叶柄含钾量的影响最大.其次为施磷肥,施氮肥和硼肥的影响最小;在施钾肥25～45g/株·次的范围内,能显著提高植株叶柄中的含钾量.施氮和钾肥对植株叶柄含镁量的影响最大,其次为施镁肥和磷肥,施硼肥的影响最小;施氮肥能提高叶柄中的含镁量,但当施氮量达35g/株·次时,增量已不显著;施钾肥有降低叶柄含镁量的趋势,当施肥量达45 g/株·次时,叶柄中的含镁量显著下降.施镁肥对植株叶柄含硼量的影响最大,其次为施磷肥,施氮肥、硼肥和钾肥的影响最小:施磷肥15、25 g/株·次时,叶柄中的含硼量相同,但当施用量达35g/株·次时,叶柄中的含硼量则显著上升.镁肥施用量不宜过大,当施用量≥0.53g/株·次时,会造成叶柄中的氮、磷、钾、镁、硼含量下降.     

BP神经网络指导番木瓜果肉制品开发

以热带水果番木瓜为原料生产果肉制品,采用模糊综合评价法对产品进行感官质量评价,通过单因素和正交实验确定柠檬酸、护色剂抗坏血酸、稳定剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、山梨糖醇添加量,采用神经网络对果肉制品工艺参数进行优化,建立神经网络模型。结果显示,柠檬酸添加量为0.105%、抗坏血酸为0.112%,CMC-Na为0.098%,山梨糖醇为7.2%时,产品的感官得分为89.93。此条件下生产的产品色泽均匀,香气浓郁,口感佳,符合卫生安全标准。     

番木瓜疮痂病菌的室内药剂筛选

为了筛选出适合大田防治番木瓜疮痂病的药剂,采用菌丝生长速率法对8种药剂进行室内药效筛选。结果表明：8种药剂对菌丝生长的抑制效果不同,从方差分析结果来看,25% 咪鲜胺乳油、10% 苯醚甲环唑可湿粉填料、50% 多菌灵可湿性粉剂和25% 丙环唑乳油的EC50极显著或显著差异优于70% 甲基托布津可湿性粉剂、50% 异菌脲可湿性粉剂、80% 代森锰锌可湿性粉剂和50% 福美双可湿性粉剂;而25% 咪鲜胺乳油、10% 苯醚甲环唑可湿粉填料和50% 多菌灵可湿性粉剂间的EC50无显著差异,其中25% 咪鲜胺乳油的EC50最小。建议在生产上推广使用25% 咪鲜胺乳油、10% 苯醚甲环唑可湿粉填料和50% 多菌灵可湿性粉剂。     

番木瓜种子原生质体制备技术的研究

以番木瓜（Carica papaya L.）成熟种子为材料,通过正交和单因素实验研究不同酶液浓度、甘露醇浓度、酶解时间、酶解pH等因素对番木瓜种子原生质体分离的影响。结果表明,高存活的番木瓜种子原生质体分离最佳条件是酶液组成为2.2％纤维素酶+0.6％离析酶、甘露醇浓度为0.7 mol/L、酶解9 h、酶解pH值为5.5。本研究奠定了原生质体遗传转化的基础,为番木瓜种子相关活性物质代谢途径的研究创造了良好的条件。     

番木瓜不同株性植株初蕾前后叶片的内源激素水平

在番木瓜初蕾前后,以嫩叶为材料,采用高效液相色谱(HPLC)技术,测定番木瓜雌株、两性株及雄株内源激素含量的变化.结果显示:番木瓜3种株性植株叶片的GA3、IAA、ZR、ABA含量在花芽分化、现蕾及开花3个发育阶段均具有明显的变化规律和差异性,且变化临界点为初蕾形成时.内源激素含量比值变化表现为,雄株在初蕾前后ZR/IAA与ZR/ABA比值一直明显高于雌株和两性株的;雌株的IAA/GA3与IAA/ABA比值在初蕾时出现1个明显的高峰值;3种株性植株叶片的GA3/ZR比值则均呈现出初蕾前较低,而初蕾后逐渐上升的趋势.