抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究

根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

转基因玉米特异性检测阳性标准分子的构建与应用

试验用PCR方法从玉米中扩增内源基因zSSIIb片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,获得中间载体pMD-zSSIIb;根据Bt11和MON810玉米转化体特异性序列,分别设计带酶切位点的引物,扩增出Bt11和MON810转化体特异性产物;用相应的酶对pMD-zSSIIb和两种PCR产物进行酶切,分别将Bt11和MON810产物克隆到pMD-zSSIIb上,获得阳性标准分子pMD-ZB和pMD-ZM,并对其进行特异性测试。结果表明,获得的阳性标准分子可以作为转基因产品检测时的阳性对照。     

第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究

为建立转基因大豆Roundup RReady2Yield"(RR2Y)转化体特异性定性PCR检测方法,以lectin基因作为内参照基因,根据RR2Y外源插入片段5'端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,从RR2Y中特异性地扩增出223bp的预期产物.对该方法进行重现性、特异性、灵敏度、稳定性和可重复性测试,结果显示:陔方法能够特异性检测出RR2Y转化体;将100%RR2Y基因组DNA用A3244基因组DNA进行梯度稀释,以100 ng DNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝;以RR2Y DNA含量为10%、1%、0.1%的样品为模板,进行稳定性和可重复性,假阴性率为0.结果表明:此方法适用于RR2Y的转化体特异性定性PCR检测.     

大豆转化体E8A7027外源T-DNA分析及特异性检测体系建立

为进一步分析转AgGlpF基因耐盐转基因大豆E8A7027转化体的分子特征信息并对其进行特异性检测,本研究分离该转化体的旁侧序列并建立其特异性PCR检测体系。基于基因组重测序技术并结合Sanger测序技术,将基因组重测序分析获得的序列信息与参考大豆基因组进行对比,确定E8A7027转化体的T-DNA区在大豆基因组上的插入位点及其5′端和3′端的旁侧序列。根据旁侧序列设计PCR检测引物,并对检测体系的特异性、灵敏度进行实验室内验证。结果显示：转基因大豆E8A7027的整合位点为Chr09染色体的33886331位点,整合方式为单拷贝插入,受体基因组DNA在插入位点缺失了1段58 bp序列,分别获得E8A7027大豆的5′端旁侧序列910 bp和3′端旁侧序列802 bp。根据这两个旁侧序列设计引物建立的PCR检测方法,能够特异性地将E8A7027大豆转化体与其他转基因作物和非转基因大豆区分开,方法的检测灵敏度为0.05%。研究结果可为E8A7027转化体的安全评价和监管检测提供技术支撑。     

土壤磷素高效利用转基因大豆特异性PCR检测方法

华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03－3（YC03-3）,获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。以AP15-1为研究对象,应用TAIL－PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。     

PCR对转基因玉米MON810的鉴定检测

本研究成功建立了商业化种植的转基因玉米MON810的筛选检测和品种鉴定的PCR方法.该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因扩增226 bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增CaMV35S启动子基因195 bp片段,可以对MON810转基因玉米进行筛选检测;此外,根据MON810品种设计的特异性鉴定检测引物,可扩增Maize genome/CaMV35S基因170 bp片段和HSP/CryIA(b)基因194bp片段,具有很强的品种特异性,达到了对MON810转基因玉米的品种鉴定目的.PCR反应循环参数是94℃2 min;94℃40sec,55℃60sec,72℃60sec,35次循环;之后72℃延伸5 min。     

定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。     

利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

应用PCR-DHPLC技术高通量快速检测转基因玉米

利用多重PCR结合DHPLC技术首次建立转基因玉米高通量快速检测方法。根据公布的转基因玉米外源基因序列设计并合成适合多重PCR的引物序列,以转基因玉米为模板,通过优化多重PCR和DHPLC的反应条件,建立一套同时快速筛选检测玉米中多种转基因成分的7重PCR-DHPLC检测方法。该方法的检测灵敏度为0.195 ng/μL,质粒检测灵敏度为1×103拷贝/μL。     

对导入Suwan1玉米种质选育自交系的评价

试验选用地方常用系甸骨11A、红玉米、长3、Mo17、黄早四导入Suwan1种质选育的自交系5份,分别与选定测验种杂交。通过改良系与未改良系、改良杂交种与未改杂交种的比较,结果表明改良系生育期延后,穗行数增加、百粒重下降、单株产量提高,增产幅度在3.9%～43.5%。改良系与选定测验种的杂种优势表现:甸骨11A改良系与红玉米、红玉米改良系与甸骨11A、长3改良系与海014的产量对照优势显著高于相邻对照;红玉米改良系与C500、Mo17改良系与B73和444的产量对照优势为正,长3改良系与龙抗11,黄早四改良系与Mo17和8112的产量对照优势为负,但与相邻对照差异均不显著;甸骨11A改良系与早大黄的产量对照优势为负并差异显著,其杂交种丝黑穗发病率25.3%。     

部分近亲玉米自交系的配合力分析

通过对 10个部分近亲玉米自交系主要农艺性状配合力的分析 ,结果表明 :10个性状的配合力差异显著。单株产量前 10名的组合 ,都有黄早四或黄改系的参与。“唐四平头群×改良Reid群”、“唐四平头群×Mo17亚群”是陕西省主要的杂交优势利用模式。     

导入外源DNA改良玉米自交系

该项目研究是将优良玉米自交系丹340、巴西抗病玉米杂交种以及大豆的总DNA,通过花粉管通道法分别导入玉米自交系7922、E28和黄428,对花粉管导入技术进行研究。改良7922自交系的株高和穗位比对照平均降低44 cm和22 cm;改良E28自交系S6的抗病性显著提高;改良黄428自交系A33和A35的干物质含量明显增加。     

导入热带、亚热带玉米种质选育自交系及其杂交种的研究

试验选用8份导入热带、亚热带种质选育的自交系,每份自交系分别选2个测验种,采用对比法设计。结果表明:系14导入中甸二黄马/EVT5、墨黄9选系和Mo17、吉63组配的杂交种产量对照优势均为正值。其中系14导入墨黄9选系杂交种的对照优势分别为15.8%和14.5%。自330导入5-56、辐苏1号选系和Mo17、旅九的杂交种产量对照优势均为负值。B73导入5-56、辐苏1号选系和Mo17、黄早4的杂交种产量对照优势均为正值。5003导入5-50、4-6选系和Mo17、E28的杂交种,除5003导入5-50选系×E28的对照优势为正,其它3个组合均为负值。     

几个玉米改良系主要农艺性状配合力和遗传参数的分析

采用NCⅡ设计,对几个玉米改良系主要农艺性状进行了配合力和遗传参数分析.结果表明:388-2的产量性状的一般配合力最高,为较好的改良系;7922×388-2、吉853×388-2、Mo17×389-1、Mo17×387-1的配合力总效应较高.遗传参数分析表明:穗长、行数、秃尖长主要受加性基因控制;百粒重、单株产量、穗重主要受非加性基因控制。     

10个玉米自交系的聚类分析

对伊犁州农业科学研究所育成的2个玉米自交系和国内常用的8个玉米自交系的13个性状进行聚类分析,结果表明:10个自交系被分成了7类,即掖478与C8605、449为一类,A619与242为一类,丹340、吉853、B73、Mo17和B84各为一类.根据杂优模式规律,同类之间无杂交优势,不同类之间有较大杂优模式.但我们研究的结果并非完全如此.     

Suwan与我国四大玉米种质的配合力和杂种优势分析

采用NCII设计,研究了4个Suwan群体与我国四大骨干自交系的配合力和杂种优势。结果显示:Suwan群体选系有较好的一般配合力,与四大骨干自交系有较高的特殊配合力和较强的杂种优势。其中,Suwan3的选系一般配合力较高,与丹340组配易形成较强的杂种优势。     

几个玉米骨干自交系杂交优势利用研究

利用15份玉米自交系组配试验，对其主要数量性状的GCA、SCA、TCA以及各自交系的SCA方差进行估算和分析。结果表明，各自交系的GCA、SCA方差均达极显著水平。P6C1－2－1、Y65－941－1、6166、中黄6441等4个自交系综合性状较优，是组配强优势杂交组合的优良自交系。     

基于热带玉米种质的高效诱导自交系筛选

分别以热带玉米群体苏湾1号、苏兰3号和QR273/LCH645的F2后代为受体亲本,4份具有不同来源的诱导系作父本,组配规模为20个果穗/组合的杂交后代。根据子粒的胚和胚乳显色差异鉴定出单倍体子粒,评估不同诱导系和母本群体的诱导率。结果表明,苏湾1号呈现出较其改良材料低的诱导率,随着温带血缘的增加,诱导率逐渐增加。针对相同受体材料,不同诱导系的诱导率之间存在显著差异,其中,诱导系1619表现出最高的诱导率(6.28±0.20~7.94±0.85),诱导系1613表现出最低的诱导率(1.93±0.19~3.68±0.05),诱导系1619在诱导热带种质产生单倍体方面具有较高的效率。     

几个玉米自交系的杂种优势分析

运用加性-显性及环境互作的遗传模型对2002～2004年的10个玉米自交系和45个F1代组合的10个性状进行了分析,对各性状的遗传方差分量、遗传力、杂种F1代的基因型及杂种优势进行研究。结果表明:玉米自交系的各性状绝大多数以显性效应为主,但也受环境因素影响;同一组合不同性状的显性效应值和同一性状的不同组合显性效应值有较大差异;从群体平均优势和超亲优势来看,单穗粒重、穗长、穗粗、行粒数、百粒重、株高和穗位高等性状均达到极显著水平。F1代各性状的优势明显高于F2代,可达2～3倍。