建兰胶孢炭疽菌ITS序列分析及其PCR快速检测

由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病是建兰的重要病害.为建立快速检测该病原菌的方法,以ITSl/ITS4为引物,对15个建兰胶孢炭疽菌的ITS进行PCR扩增及测序,将测定的序列与炭疽菌属其它种的ITS序列进行比对分析,设计特异性引物CFl/CR1,并通过常规和巢式PCR对建兰胶孢炭疽菌进行检测.结果显示,15个菌株中有13个菌株ITS序列与该菌的模式种序列相似性高达99％以上,而另外2个菌株相似性则为86％;供试菌株在系统发育树上聚为2个不同的分支;引物CFl/CR1通过常规PCR可从1 ng的建兰胶孢炭疽菌基因组DNA中扩增到目的条带,而利用引物ITSl/ITS4和CF1/CR1通过巢式PCR可从1 pg的基因组DNA中扩增到目的条带,即巢式PCR反应检测灵敏度较常规PCR至少高1 000倍.表明建立的巢式PCR法可从自然感病的建兰叶片组织中检测到胶孢炭疽菌.     

香蕉炭疽菌rDNA ITS区的分子鉴定与检测

 香蕉炭疽病菌(Colletordchum muscat)是一种引起香蕉采后病害的最重要病原,本研究用真菌18S~28S间的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)通用引物18SF和28SR扩增香蕉炭疽菌和其它外群真菌的基因组DNA,扩增出约510bp的片段;通过克隆测序香蕉炭疽菌的ITS全序列并与GenBank中炭疽菌属其它种的ITS序列比对,设计出香蕉炭疽菌的特异性引物ColM1和ColM2。用此特异引物可以从香蕉炭疽菌株中扩增出382bp的特异性片段,而其余20个参试菌株和香蕉组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度实验证明可以检测到目标DNA的浓度为0.1Pg。该方法可用于快速、准确和灵敏地检测香蕉炭疽菌,为快速监测组织中有无香蕉炭疽病菌潜伏侵染与及早采取防治措施提供积极的指导意义。     

纳米材料二氧化钛对胶孢炭疽菌的抑制作用

对纳米材料TiO2的性质及其对胶孢炭疽菌的抑制作用进行了研究。TiO2在190～240nm处有强的吸收峰。在短波光日光灯和蓝光下TiO2具有较强的抑菌作用，TiO2A对胶孢炭疽菌的菌丝生长、产孢量及孢子萌发抑制率分别为15．21％、54．68％、80．68％，TiO2 B为30．84％、39．70％、86．70％。TiO2 A和TiO2 B的最适抑菌浓度分别为0．5和0．4mg／ml。     

芽胞杆菌SM905的鉴定及其对铁皮石斛胶孢炭疽菌的抑菌活性研究

芽胞杆菌Bacillus sp.SM905是本实验室分离并保存的一株活性细菌,为进一步明确其分类地位及其对铁皮石斛胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的抑菌活性,利用形态学、生理生化特性及16S rDNA和gyrB序列分析对SM905进行种属鉴定;采用菌丝生长速率法、插片法和琼脂平板法测定了不同浓度的SM905发酵上清液对靶标菌菌丝生长和孢子萌发的影响;并通过盆栽试验考察其防效。结果表明,SM905为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。不同稀释倍数的SM905发酵上清液对胶孢炭疽菌均有一定的抑制作用,其中5倍稀释液对菌丝生长的抑制率最高,为97.89%,20倍稀释液的抑制率也达90%左右。处理组残留胶孢炭疽菌气生菌丝表现为畸形、空洞、色素积累等,基内菌丝产生大量的分生孢子。SM905发酵上清液不影响胶孢炭疽菌孢子的萌发率,但是导致萌发后的菌丝生长稀疏、膨大。盆栽试验结果表明,SM905粉剂100倍液间隔7 d喷施2次对铁皮石斛炭疽病的防效为80.74%,优于10%苯醚甲环唑水分散粒剂800倍液。本研究表明,芽胞杆菌SM905可以作为铁皮石斛炭疽病生物防治用生防菌,具有良好的应用前景。     

胶孢炭疽菌CgSho1基因的克隆与功能分析

HOG-MAPK(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase)信号途径是真菌MAPK途径中参与渗透压响应的一条重要通路,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。Sho1(synthetic high osmolarity-sensitive protein1)是HOG-M APK信号途径上游的一个重要感受器,在不同真菌中常具有不同的功能。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了Sho1的同源基因,命名为Cg Sho1,该基因编码一个291个氨基酸的蛋白,含有4个跨膜结构域和一个SH3功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体,与野生型相比,敲除突变体表现为营养生长缓慢,菌丝稀疏且疏水性增强,产孢量下降,对氧化压力和渗透压更加敏感,致病力明显减弱。上述结果表明,Cg Sho1参与调控胶胞炭疽菌的营养生长、分生孢子产量、氧化应激反应、渗透压响应及致病性。     

辣椒胶孢炭疽菌生物学特性初步研究

从广西南宁市采集辣椒炭疽病果实病害标本,进行病原菌分离培养、致病性测定及形态学鉴定,选择引起辣椒炭疽病的病原菌之--胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)进行生物学特性研究,结果表明:在测试的不同温度、pH、湿度、光照和营养中,该菌的菌丝体生长和产孢的最适温度分别为25℃和30℃,菌丝体生长和产孢的最适pH值为7,光照对菌丝生长的影响不大,在光暗交替下可促进产孢;分生孢子萌发的最适温度为30℃,最适pH值为7,分生孢子在相对湿度为100%和100%+水滴中能萌发,在100%+水滴中萌发率最高,为99.5%,光照对孢子萌发影响不大;辣椒煎水和辣椒煎水+蔗糖可促进附着胞形成,附着胞在辣椒煎汁中形成率最高,达到90%.     

红掌细菌性疫病病原菌的PCR特异性检测

 红掌细菌性疫病(Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae,简称Xad)是红掌等天南星科花卉毁灭性病害,该病通过带菌种苗调运不断在我国扩散蔓延,国内尚未有检测方法。通过筛选和重新设计引物,建立了Xad 的PCR 检测方法,结果表明,利用引物Xad-F / Xad-R 进行PCR,能扩增出检测Xad 的特异性DNA 片断,其灵敏度可达1 × 102 CFU / mL,DNA 的最低检出限为0. 44 ng / μL,可用于红掌苗的带菌检测和红掌细菌病害的鉴定。     

黑麦草腥黑粉菌分子检测方法的研究

寄生于黑麦草属植物有4种腥黑粉菌,分别是小麦矮化腥黑穗病菌(Tilletia.Controversa(TCK))、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)、黑麦草粒腥黑粉菌(T.walkeri)和新种(T.vankyi)。其中TCK、T.lolli和T.vankyi冬孢子形态非常相似,难以区分。本研究以寄生于黑麦草上的这3种腥黑粉菌为研究对象,设计T.lolli的特异引物,成功建立了T.lolli冬孢子的套式特异PCR检测方法。     

橡胶树胶孢炭疽菌复合群LAMP检测方法的建立及应用

由胶孢炭疽菌复合群(Colletotrichum gloeosporioides species complex)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一。本研究以β-tubulin基因为靶标基因,设计橡胶树胶孢炭疽菌复合群特异性引物,以SYBR Green I为指示剂,建立了特异性强、灵敏度高的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,进行了室内侵染和田间自然发病样品的检测验证。结果表明,该方法能在63℃恒温条件下60 min内检测出病原菌,且能特异性识别我国主要植胶区的橡胶树胶孢炭疽菌。该方法最低检测限为1 pg DNA或100个分生孢子。室内和田间样品检测结果表明,该方法可同时检测出潜伏侵染期和发病期的胶孢炭疽菌。本研究建立的LAMP检测方法为橡胶树胶孢炭疽菌的快速鉴定提供了新技术。     

炭疽菌属几个重要种的分子系统学研究

 炭疽菌属(Colletotrichum Cda.)分布广泛,是一重要的植物病原真菌属,尤其在热带和亚热带地区。由于形态特征差异微小和不稳定,该属的分类一直较为混乱。本文应用RAPD和ITS-RFLP 2种分子生物学方法对炭疽菌属几个重要种的种间和种内亲缘关系进行研究,为该属的分类提供了有用的分子依据。     

危害红掌的穿孔线虫形态和分子鉴定

对一批引进后隔离培养中患病的红掌种苗,进行了根系线虫检测,通过病症分析、线虫形态测量、rDNA-ITS区序列分析等鉴定,结果表明:检测的线虫形态和香蕉穿孔线虫基本一致,rDNA-ITS区测序结果序列一致性为98％～100％.本报道再次证明香蕉穿孔线虫在红掌上的分布和危害,应该对种苗的跨区引进和种植过程进行严格的检疫.     

红掌青枯病的症状和病原菌鉴定

 描述海南儋州某红掌栽培基地红掌发生青枯病的症状,根据对该病原菌的形态、染色反应、培养性状、生理生化特性的测定结果,将病原菌鉴定为茄青枯拉尔氏菌[Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.]。通过对病原菌的寄主范围测定,病原菌属茄青枯拉尔氏菌小种1,根据对6种糖、醇利用的测定结果,病原菌属于生物变种3。     

Molecular and biochemical characterization of Colletotrichum gloeosporioides isolates resistant to azoxystrobin from grape in China

Anthracnose, caused by Colletotrichum gloeosporioides, is one of the most important diseases in grape-growing regions worldwide. In Jiangsu Province of China, quinone-outside inhibitor fungicides (QoIs) have been extensively sprayed as disease control for more than 10 years. A spore germination assay of 64 isolates obtained from 32 commercial vineyards was used to assess isolate sensitivity to azoxystrobin and 62 were found to be resistant to azoxystrobin. The biological fitness of QoI-resistant (QoI^R) isolates was significantly lower than the sensitive isolates (QoI^S) in terms of mycelial growth and conidiation. Nucleotide sequence alignment of CgCytb genes from the QoI^R and QoI^S isolates revealed that two point mutations (F129L and G143A) are involved in the QoI resistance. Isolates with the G143A mutation expressed high resistance to azoxystrobin, whereas isolates carrying the F129L mutation exhibited moderate resistance. Positive cross-resistance was observed between azoxystrobin and kersoxim-methyl, pyraclostrobin, or benzothiostrobin, but not with fluazinam. This study provides important information for management of QoI^R populations of C. gloeosporioides in the field.     

Molecular identification of Colletotrichum gloeosporioides causing yam anthracnose in Nigeria

Four forms of Colletotrichum representing three distinct virulence phenotypes were found associated with foliar anthracnose of yam in Nigeria: the highly virulent (= severity of disease) slow-growing grey (SGG); the moderately virulent fast-growing salmon (FGS); the weakly virulent fast-growing grey (FGG); and the moderately virulent fast-growing olive (FGO) morphotype. Isolates of the four forms were identified as C. gloeosporioides , based on morphology. The reaction of monoconidial cultures on casein hydrolysis medium (CHM), PCR-RFLP and sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA (ITS1-5·8S-ITS2) were used to establish the identity of the yam anthracnose pathogen(s). All yam isolates were distinguished from C. acutatum by the absence of protease activity on CHM. On ITS PCR and enzymatic digestion of PCR products, all FGS, FGO and SGG isolates produced RFLP patterns identical to those of C. gloeosporioides reference isolates, while FGG isolates revealed unique ITS RFLP banding patterns. Sequence analysis of the ITS1 region and of the entire ITS region revealed that SGG, FGS and FGO isolates were highly similar (98–99% nucleotide identity) and showed 97–100% identity to C. gloeosporioides . Less than 93% similarity of these fungal isolates to reference C. acutatum and C. lindemuthianum isolates was observed. The molecular study confirmed that foliar anthracnose of yam is caused by C. gloeosporioides . While a high similarity was found among most C. gloeosporioides fungi from yam, isolates of the FGG form did not cluster with any previously described Colletotrichum species, and probably represent a distinct species.     

火把对柑桔炭疽病菌的室内毒力试验

采用菌丝生长速率法,用杀菌剂火把对柑桔炭疽病菌进行了室内毒力测定,测得火把对柑桔炭疽病的EC50值为0.8110μg/mL,EC98值为10.5435μg/mL,确定了其在室内有效抑菌浓度。本试验有利于指导进一步的室外药效试验以确定实际应用中的最佳施用浓度。     

江苏省葡萄炭疽病菌群体对4种杀菌剂的敏感性

为明确江苏省葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides群体对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇4种杀菌剂的敏感性和抗性水平,本研究采用菌丝生长速率法测定了来自江苏省7个地区的68株葡萄炭疽病菌对上述4种药剂的敏感性,建立敏感基线,并分析菌株抗性水平和抗性频率。结果表明：苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇对供试68株葡萄炭疽病菌的EC₅₀范围分别为0.03～1.20、0.05～3.48、0.14～1.20 mg/L和0.50～12.30 mg/L;对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈的敏感基线分别为(0.53±0.032)(1.00±0.15) mg/L和(0.38±0.024) mg/L。68株菌株对戊唑醇的EC₅₀平均值为3.61 mg/L,因敏感性频率分布不符合建立敏感性基线要求,故未建立敏感性基线。供试菌株对苯醚甲环唑均表现为敏感,对吡唑醚菌酯和咯菌腈呈现一定的低抗水平,抗性频率分别为4.41%和3.03%;对戊唑醇呈低抗和中抗水平,抗性频率分别为16.18%和5.88%。该研究为防控江苏省葡萄炭疽病提...     

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。     

草莓胶孢炭疽菌CFEM候选效应子的生物信息学鉴定及其侵染过程中的转录分析

病原真菌通常分泌效应子到寄主组织中调控寄主的生理过程,从而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所独有的,且与致病性密切相关。本研究利用Pfam数据库对草莓胶孢炭疽菌全基因组进行搜索,鉴定获得22个CFEM蛋白。对CFEM蛋白的信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位进行分析,结果表明仅有8个CFEM蛋白为分泌蛋白。对CFEM分泌蛋白在不同侵染阶段的转录情况进行转录组学及RT-PCR分析,结果显示8个CFEM蛋白在侵染后不同时期均有表达。其中,1个CFEM分泌蛋白于附着胞形成期特异表达,2个于活体寄生阶段特异表达,2个于死体寄生阶段特异表达。综合上述分析结果,预测这8个分泌蛋白可能为草莓胶孢炭疽菌的效应子。本研究为深入解析植物病原真菌CFEM效应子提供了理论依据。     

不同油茶种和品种对炭疽病的抗性观察

在林间调查了广东省内栽培的高州油茶、广宁红花油茶和39个品种的普通油茶对油茶炭疽病的抗病性,并在室内研究了高州油茶、广宁红花油茶和9个品种的普通油茶叶片对炭疽病的抗病性。林间自然状态下调查结果表明,广宁红花油茶对炭疽病的抗病性最强,普通油茶‘粤韶77-1号’、‘铁城1号’和‘湘林1号’抗性中等,其他品种均表现为感病;室内测定结果表明,广宁红花油茶属于抗病种类,‘铁城1号’和‘粤韶77-1号’属于中度抗病品种,其他为感病品种。