鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

PRRSV新疆株N基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已发表的毒株,设计了一对引物扩增PRRSV新疆株N基因片段;将N基因克隆到pMD18-T,在亚克隆到pGEX-6p-1原核表达载体上,构建重组质粒pGEX-6p-N;在37℃条件下,经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达4h后,获得了可溶性融合蛋白;经SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析,该融合蛋白分子量约为39kDa,与预期结果一致,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,且非特异性背景很低。     

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。     

油菜COR基因的克隆及原核表达

以冬油菜陇油6号叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到油菜COR基因编码区序列,全长390 bp。将其与大肠杆菌表达载体p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-COR,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测结果表明该基因表达了1个约14.3 k D的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

小鼠IL-10基因的克隆及其原核表达

从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达.     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

羊口疮病毒115基因的克隆及原核表达

【目的】获得羊口疮病毒（ORFV）115基因表达蛋白。【方法】利用Oligo 7软件设计并筛选出115基因特异性扩增引物,以ORFV FJ-ND株基因组为模板,通过PCR技术扩增获得其基因序列,再将115基因克隆至pGEX-6p-1上,重组质粒pGEX-6p-115,并对其进行测序鉴定,鉴定正确后转化RosettaganmiB(DE3)感受态细胞,通过优化IPTG浓度和诱导时间获得重组融合蛋白最佳表达条件,用SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行分析。【结果】115基因全长450 bp,编码149个氨基酸;115基因可以在RosettaganmiB中表达,重组蛋白分子大小约42 kDa,主要以包涵体形式表达。【结论】成功克隆了ORFV 115基因,构建了pGEX-6P-115原核表达质粒,优化了重组蛋白表达条件并进行纯化,为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

金黄色葡萄球菌多药耐药基因norA的克隆及其原核表达

按金黄色葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增出norA基因中1155bp cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌JM109中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经Nde Ⅰ和XhoⅠ酶切，回收1155bp目的片段，定向克隆到pET28a（＋）表达载体中，转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出norA基因的表达。     

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

新城疫病毒HN基因的克隆与原核表达

根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。     

微小隐孢子虫Cp735基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从微小隐孢子虫基因组中扩增cp735基因.与pMD- 18T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析.用基因重组技术将Cp735基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建Cp735基因的重组原核表达载体pET28a-Cp735.将pET28a-Cp735在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并用SDS- ...     

内切葡聚糖酶基因的克隆及原核表达

纤维素酶的工业应用一直受成本高、酶活低的限制,而内切葡聚糖酶作为纤维素酶最主要的组成部分,提高内切葡聚糖酶的酶活力显得尤为重要。根据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KCTC的模式菌株和解淀粉芽孢杆菌HZ79内切葡聚糖酶序列的相似性及orf分析设计特异性引物,以解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA为模板,利用PCR反应克隆出长为1 500 bp的内切葡聚糖酶基因(egl基因),将目的基因与pMD19-T载体相连,转入大肠杆菌DH5α,阳性克隆经菌液PCR及双酶切验证,将验证正确的质粒送金唯智测序公司测序。比对结果表明:该克隆片段无碱基缺失,无移码突变,扩增序列准确、可靠。将测序正确的重组质粒转化BL21,进行大肠杆菌BL21(DE3)的原核表达,SDS-PAGE分析蛋白的大小为55 ku,等电点为8.12。为后续的内切葡聚糖酶基因突变体文库的建立,及egl酶酶活力及耐受性提高菌株的高通量筛选奠定前期基础。     

独行菜法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与原核表达

从独行菜(Lepidium apetalum)中克隆强心苷合成途径的法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因,并在大肠杆菌中表达,为进一步研究独行菜强心苷的合成途径提供参考。分析前期获得的独行菜幼苗转录组数据,选择其中注释为FPS且具有完整开放阅读框的序列,从独行菜叶片c DNA中通过PCR克隆该序列,并进行序列分析。结果表明,克隆得到独行菜FPS基因的cDNA序列,Gen Bank登录号KY366218,命名为La FPS。序列长度为1 332 bp,含有1 161 bp的开放阅读框,推测编码386个氨基酸。La FPS蛋白可能不含跨膜结构,定位于线粒体中,含有聚异戊二烯合成酶结构域。La FPS蛋白氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)FPS1蛋白相似性高达92%,进化树分析结果表明,La FPS与同为十字花科的拟南芥FPS1、遏蓝菜(Noccaea caerulescens)FPS1、高山南芥(Arabis alpina)FPS亲缘关系最近。构建的载体p ET-32a-La FPS可在大肠杆菌中成功诱导表达。表明成功克隆了独行菜FPS基因,并建立了其原核表达体系。     

拟南芥AtCpNifS克隆及其原核表达

从哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)中克隆了AtCpNifS的完整CDS序列。通过测序和序列比对分析,确认了克隆序列的完整性和正确性。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体(BL21-pET28-AtCpNifS),并从该质粒中成功分离了表达蛋白(AtCpNifS)。