西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。     

口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建

根据si RNA设计原则,分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点,设计了2个si RNAs,并将si RNAs克隆到p SIREN-Shuttle中,获得2个si RNA重组表达载体p Shuttle-L和p Shuttle-2B。用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切si RNA重组表达载体和腺病毒质粒载体p Adeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组腺病毒质粒p Adeno-L和p Adeno-2B。     

奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。     

CyclinE基因siRNA真核载体的构建及干扰效果的初步鉴定

根据CyclinE（细胞周期蛋白E）基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向（＋797～＋819）位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.     

CyclinE基因siRNA真核载体的构建及干扰效果的初步鉴定

根据CyclinE(细胞周期蛋白E)基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向(+797～+819)位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.     

A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代.     

番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。     

SARS病毒E基因的克隆与重组腺病毒rAdE-E的构建

为了进一步研究SARS病毒E蛋白的功能以及在SARS致病机理中的作用,我们通过touch-down PCR程序,从SARS病毒WHU株(GenBank accession number AY394850.1) cDNA文库中扩增了E基因,并通过基因工程技术及腺病毒系统构建了重组腺病毒rAdE-E.DNA测序、酶切鉴定及荧光检测(GFP表达)结果均表明:重组腺病毒rAdE-E构建成功.     

野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进及其鉴定

目的为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coliBJ5183(Ad-1 cells),以获得重组腺病毒质粒,经限制酶PacⅠ线性化后,转染293细胞,检测PTEN蛋白的表达,并以Ad-PTEN感染人乳腺癌MCF-7细胞后,测其感染率。结果获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(Ad-PTEN),受Ad-PTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因PTEN,荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。Ad-PTEN感染的人乳腺癌MCF-7细胞,感染率达80%~90%。结论PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建,方法较简便、快速,且生成的病毒滴度高、感染率高。     

大豆解螺旋酶基因GH1的克隆与载体构建

非生物胁迫（高盐、低温、干旱）严重限制植物的生长与发育。研究表明,高等植物中的DEAD-box RNA解螺旋酶广泛参与植物非生物胁迫应答,过表达解螺旋酶基因可明显改良转基因植株的抗逆能力。目前,大豆的RNA解螺旋酶基因序列也已发现,但其具体功能还不明晰,有待进一步研究确定。本实验以大豆为实验材料,根据Genbank发表的RNA解螺旋酶基因GH1的序列设计引物,通过RT-PCR的方法将其体外扩增并构建相应的表达载体,为下一步的研究奠定基础。     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。     

重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定

干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1*。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建（摘要）（英文）

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PD-NR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

Pti5基因植物双元表达载体的构建及鉴定

Pto基因编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,对番茄细菌病具有良好抗性。Pti5是与Pto互作的蛋白质,Pti5蛋白与广泛存在的病程相关蛋白基因（PR基因）中的顺式元件相结合,可增强PR基因的表达,为提高植物抗病性提供了有效的途径。本研究将Pti5基因构建到植物双元表达载体pBI121上,获得pBI121UCH1重组质粒,并将该质粒转到根癌农杆菌LBA4404中,为植物利用根癌农杆菌转化系统转Pti5基因进行抗病基因工程育种奠定了基础。