鸽MX基因的克隆及序列分析

本实验利用干扰素诱导剂Poly(I:C)诱导鸽成纤维细胞,提取细胞总RNA,根据Gen Bank中公布的鸽基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增白卡奴鸽MX基因全长编码区序列。结果表明:白卡奴鸽MX基因编码区长2 106 bp,编码701个氨基酸残基,推测蛋白分子量大小为79.7 ku,等电点为6.37;通过与Gen Bank中已登录的脊椎动物MX基因序列对比,核苷酸序列的同源性为54.0%~78.0%,氨基酸序列的同源性为41.3%~69.3%。本实验成功克隆了白卡奴鸽MX基因,证实其编码的蛋白具有脊椎动物MX基因共有的结构特征,为进一步研究白卡奴鸽MX基因的抗病活性及其作用机制奠定了基础。     

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列（登录号：D84097.1）设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点（pI）为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

绦虫催乳素基因cDNA克隆及序列分析

根据文献报道的脊椎动物催乳素基因 c DNA序列的保守区 ,设计 1对引物。提取绦虫总 RNA,采用 RT- PCR扩增绦虫催乳素基因 ,琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物 ,将回收产物连接到 p MD- 18T克隆载体 ,对待选克隆进行 PCR和酶切鉴定。阳性克隆进行序列测定 ,获得全长 893bp的 c DNA序列 ,共编码 2 2 2个氨基酸 ,其中前 2 2个氨基酸为信号肽 ,成熟蛋白共编码 2 0 0个氨基酸。将测序结果与 Gen Bank中已知序列比较 ,推导氨基酸序列并进行活性位点分析 ,所得序列与脊椎动物催乳素同源性最高 ,含有催乳素的 2个活性区域 ,证明所得到的序列就是催乳素序列。     

鸡Cacnals基因部分序列的克隆及分析

利用PCR方法首次克隆了鸡Cacnals基因5'一部分调控区和exon1共1 863bp的序列,该序列已提交GenBank,登录号为GQ184725.同源性比对发现,鸡Cacnals基因exon1与哺乳动物同源性较高,其核苷酸相似性在72.4%～77.0%,氨基酸相似性在66.0%～2.0%.鸡Cacnals基因exon1较哺乳动物插入了9个碱基,分别编码1个高疏水性的缬氨酸和2个高亲水性的天冬氨酸和赖氨酸.Cacnals基因部分序列的克隆,可为下一步在鸡上开展此基因与肉质和屠体性状的关联性研究奠定基础.     

家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析

1972年瑞典斯德哥尔摩大学Boman HG等用大肠杆菌注射惜古比天蚕蛹,从人工诱导的天蚕免疫血淋巴中发现了抗菌物质,并提纯得到了抗菌肽,并对它们进行了氮基酸序列测序分析,确定了抗菌肽的一级结构,命名为天蚕素（Cecropins）。随后研究表明,天蚕素族抗菌肽主要存在于鳞翅目昆虫,也存在于其它目昆虫体内．如双翅目的果蝇（Drosophila melanogaster）、麻蝇（Sarcophaga peregrina）、     

蛔虫抗原基因ALAg克隆及序列分析

为了确定蛔虫基因工程疫苗的候选基因,试验以蛔虫幼虫的RNA为模板,利用RT - PCR方法扩增出ALAg基因,扩增产物克隆到pMD18 -T载体,筛选阳性克隆测序并进行Blast分析.结果表明:该基因与GenBank公布的猪蛔虫As37抗原基因(AB078971)的同源性为95％,与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927...     

羊肌细胞生成素基因内含子的克隆及序列分析

以羊MyoG基因的内含子为研究对象,参考羊和猪MyoG基因的mRNA序列信息,选取保守基因序列设计上下游引物,采用PCR方法,首次成功克隆出羊MyoG基因内含子Ⅰ和内含子Ⅱ,并进行序列测定（GenBank登录号：DQ453548）.序列分析比较发现内含子Ⅰ的片段与猪的同源性为71.9%,与人的同源性为65.7%;内含子Ⅱ的片段与猪的同源性为77.9%,与人的同源性为62.7%.说明该基因的内含子在不同物种间具有较高的同源性.     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号:GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

蒺藜状苜蓿中MtERF-6基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对蒺藜状苜蓿Medicago truncatula测序的数据库进行分析,设计合成引物,通过RT-PCR扩增得到了乙烯反应元件结合蛋白基因(MtERF-6),并测定了其核苷酸全序列.该基因完整的读码框包括654 bp,编码218个氨基酸.用此片段的氨基酸序列通过GenBankBLAST分析表明,该基因属于EREBP(Ethylene responsive element binding proteins)家族,其核苷酸与已报道的ERF4[Gossypium hirsutum]、ATERF-9[Arabidopsis thaliana]、NtERF3[Nicotiana tabacum]、NsERF3[Nicotiana sylvestris]、CaEREBP-C1[Capsicum annuum]的相似性分别为45%、47%、41%、40%和42%,是新的基因.MtERF-6的核酸序列在GenBank发表,登录号为DQ344024.     

羊驼生长激素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和PCR技术克隆得到了羊驼生长激素(Growth hormone,GH)基因,包括完整的编码区812 bp 的cDNA序列和1 800 bp 的DNA序列.两者比对后证明羊驼GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽.序列比较结果表明,羊驼GH基因序列与骆驼、猪、马、犬和猫等哺乳动物类似,但羊驼GH基因的启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而同骆驼一样为CATA盒.在DNA和cDNA水平以及推导的氨基酸水平,均与骆驼的同源性最高.通过GH氨基酸的功能位点分析推测,羊驼生长激素与人、猪等大多数动物的生长激素无明显功能上的差异.     

饲用木聚糖酶基因的克隆及序列分析

以实验室自行分离筛选出的产木聚糖酶短小芽孢杆菌HZ-01的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到一条含有木聚糖酶基因的DNA片段,对其进行序列比对及生物信息学分析,结果表明,该基因全长为687 bp,编码228个氨基酸,理论分子质量约为25 kDa,存在4个潜在的N-糖基化位点,密码子使用存在偏爱性.     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT—PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因，并克隆入pcDNA3．1-CT—GFP真核表达载体中构建重组质粒，用该重组质粒在脂质体介导下转染VeroE6细胞，GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达，通过Western—blot分析，细胞裂解液样品中有1条约66ku的条带，可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别，与预计大小一致，说明，真核表达载体pcDNA3．1-CT—GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达，表达产物具有抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒新疆分离株E2基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法从牛病毒性腹泻病毒（BVDV）新疆石河子分离株、玛纳斯不同年份两个分离株扩增获得的3株BVDV的E2基因序列,分别命名Shihezi148、Manasi和MNS2（GenBank登录号：EU159699、EU159703和EU169937）。序列分析结果表明3株E2基因长度分别为1121bp、1122bp和1122bp,分别编码373、374和374个氨基酸残基。核酸序列同源性和系统发生分析表明,3株病毒均属于BVDV基因1型（BVDV-1）,Shihezi 148株与澳大利亚Bega株亲缘关系最近,同处于BVDV-1c基因亚型群,其E2氨基酸同源性为90.11%。Manasi株和MNS2株E2基因核酸序列仅有4个碱基的差别,它们与Changchun 184和匈牙利VEDEVAC株亲缘关系最近,位于BVDV-1b基因亚型群。Manasi和MNS2株与Changchun 184株E2氨基酸同源性分别高达98.66%和98.93%。     

红砂肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

肌动蛋白(Actin)基因是研究植物功能基因表达模式中最常用,也是最重要的内参基因。本研究以泌盐型强旱生植物红砂(Reaumuria soongorica)地上部总RNA为模板,根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR方法克隆其Actin基因片段。序列分析结果表明,该基因片段长度为598 bp,编码198个氨基酸,与GenBank中登陆的其他植物Actin基因核苷酸序列和氨基酸序列的一致性分别在82%和90%以上,说明其为Actin基因片段,命名为RsACT。进化分析显示,RsACT与陆地棉(Gossypium hirsutum)和白杨(Populus trichocarpa)肌动蛋白的亲缘关系最近。     

蛔虫抗原基因ALAg克隆及序列分析

为了确定蛔虫基因工程疫苗的候选基因,试验以蛔虫幼虫的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出ALAg基因,扩增产物克隆到pMD18-T载体,筛选阳性克隆测序并进行Blast分析。结果表明:该基因与GenBank公布的猪蛔虫As37抗原基因(AB078971)的同源性为95%,与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927450)的同源性为92%。说明ALAg基因是线虫特有的抗原基因。     

兔豆状囊尾蚴Tp14基因的克隆及其序列分析

为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。