毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达

从毛白杨中分离7个纤维素合酶基因,分别为PtoCesA4,PtoCesA5,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA13,PtoCesA17和PtoCesA18,通过与已公布的毛果杨全基因序列及拟南芥和水稻基因组中纤维素合酶基因序列的同源性比对分析,结合目前纤维素合成机制的研究进展,预测毛白杨中上述不同纤维素合酶的功能。利用GenomeLabTMGeXP遗传分析系统分析毛白杨中纤维素合酶基因在不同组织中的转录表达水平,结果表明PtoCesA4,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA17和PtoCesA18在木质部高丰度表达,推测这些基因可能参与毛白杨次生细胞壁的形成,为毛白杨次生细胞壁中纤维素的合成调控提供参考依据。     

青杄转录因子基因PwNF-YB8的克隆与功能分析

【目的】NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)转录因子在真核生物中广泛存在,通常由NF-YA、NF-YB和NFYC 3个亚基形成异源三聚体,来结合下游靶基因启动子中的CCAAT顺式作用元件,进而调控植物的生长发育进程,并参与植物非生物逆境胁迫过程。本研究对青杄中PwNF-YB8基因的表达特性及功能进行分析,揭示其参与的生理过程及对非生物逆境胁迫的响应。【方法】根据实验室前期EST测序及RNA-seq转录组数据分析结果获得青杄NF-Ys家族基因序列,克隆得到PwNF-YB8的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用qRT-PCR分析PwNF-YB8在不同组织和花粉萌发过程中的表达特性,以及高温、盐胁迫、甘露醇、ABA处理后的表达变化。亚细胞定位揭示PwNF-YB8在细胞中发挥功能的场所。通过酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验分别检测PwNF-YB8的转录激活活性以及与PwHAP5的互作情况。农杆菌介导花序侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwNF-YB8过表达株系。利用CRISPR/Cas 9技术获得其同源基因AtNF-YB8的突变体。甘露醇和盐处理后测定野生型(WT)、空载体(VC)、突变体株系(nfyb8-cas9#1/12)和过表达株系(L4、L5)的萌发率、幼苗根长,分析比较不同株系对于渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力。【结果】PwNF-YB8基因的开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,具有典型的NF-YB保守结构域,并且与白云杉同源基因具有较近的亲缘关系。SqRT-PCR和qRT-PCR结果表明在青杄的根、茎、针叶和花粉中均能检测到PwNF-YB8的表达,其在花粉中的表达量最高。亚细胞定位试验结果显示,PwNF-YB8定位于细胞核、细胞质中。酵母自激活试验显示PwNF-YB8自身无转录激活活性。进一步对青杄幼苗进行高温(42℃)、盐胁迫、甘露醇和脱落酸处理后发现,PwNF-YB8对干旱和盐2种非生物逆境处理明显响应。PwNF-YB8参与了花粉萌发过程,在花粉萌发36 h时表达量最高。酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明PwNF-YB8能够与NF-YC亚基中的PwHAP5互作,可能共同参与花粉管发育调控。甘露醇或盐处理下,异源过表达PwNF-YB8基因的拟南芥种子萌发率与野生型差异不显著,但其根长表现出一定的生长优势。【结论】青杄PwNF-YB8能够与PwHAP5互作,参与花粉萌发和花粉管生长过程,并在干旱、盐胁迫响应中发挥作用。     

毛竹NLP转录因子鉴定及其响应氮素的表达模式

目的 鉴定毛竹中NLP家族成员,为深入研究毛竹NLP分子调控机制奠定基础。 方法 采用生物信息学方法鉴定并系统分析毛竹NLP成员的分子特征,用实时荧光定量PCR (qPCR)技术检测毛竹NLP响应氮素的表达模式。 结果 毛竹中鉴定出10个NLP成员(PeNLP1～PeNLP10),其蛋白长度为714～963 aa,分子量为77.41～105.08 kDa,理论等电点介于5.36～6.25之间;亚细胞定位预测结果表明,除PeNLP9定位于叶绿体外,其余成员均定位于细胞核内。系统进化分析表明：PeNLPs分成3个组,各组成员分别为4、2、4个。PeNLPs均包含4个内含子,不同成员内含子的大小和位置存在一定的差异;PeNLPs内有共线性基因对6个,PeNLPs和OsNLPs之间有共线性基因对9个,且它们的Ka / Ks均小于1,说明其在进化上经历了纯化选择。组织特异性分析表明,有的PeNLPs呈组织特异性表达,有的则呈组成型表达。PeNLPs受到氮饥饿诱导表达,在1 h内PeNLP1的表达量显著上调,其它5个PeNLPs则显著下调(p < 0.01);对氮饥饿72 h后的毛竹进行复氮处理,在24 h内所有PeNLPs的表达量均显著或极显著上调(p < 0.05或p < 0.01)。 结论 毛竹中NLP家族有10个成员,各成员的分子特征和组织表达特异性存在一定的差异,PeNLPs的表达能够对氮饥饿作出快速响应,且在氮饥饿后复氮过程中显著上调表达,响应氮素的诱导。     

沙质地毛白杨节水灌溉栽培模式分析

以壤土、冬小麦秸秆和塑料膜等为材料，在沙质地上进行了毛白杨节水灌溉栽培试验。５ａ研究结果表明，掺壤土（秸秆）改土、铺塑料膜蓄水等技术措施，均对幼树的成活和生长（胸径、树高、枝条、叶面积）产生了明显的促进作用，掺壤土改土措施的幼树成活率和叶面积分别较对照提高了８３％和２１２％；根据存活、生长及经济效益，提出了适于沙质地节水灌溉栽培的５种栽培模式。     

毛白杨叶片保护酶活性等对干旱胁迫的响应

通过盆栽控水试验研究了不同水分胁迫条件下毛白杨(Populus tomentosa)8个1(2)-O型无性系苗木叶片中膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的动态变化过程.结果表明,随干旱胁迫强度的增大,毛白杨无性系叶片的MDA含量、CAT活性呈递增...     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

北美鹅掌楸YABBY转录因子家族的鉴定与表达分析

【目的】YABBY转录因子家族仅存在于种子植物中,对植物的早期胚胎发育、果实发育、次生代谢物合成、逆境应答、侧生器官分化和背腹极性建立等方面均具有重要作用,而目前对鹅掌楸属植物的YABBY家族基因的研究较少。为了解北美鹅掌楸YABBY家族的成员和特征,对其成员进行了鉴定、亚细胞定位及表达模式分析等研究工作。【方法】从北美鹅掌楸花器官转录组中筛选出YABBY家族基因序列,采用RACE扩增技术获得了其中2个差异表达基因的全长,分别命名为LtYABBY1,5,并对他们进行生物信息学分析。随后,利用RT-qPCR检测LtYABBY1,5在北美鹅掌楸的根、茎、叶、花芽、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等8个组织中的表达水平。最后,通过烟草瞬时转化体系对LtYABBY1,5蛋白进行进一步亚细胞定位分析。【结果】在北美鹅掌楸中共鉴定出6个YABBY成员,分别属于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5亚族,外显子数量均为7个。克隆所得其中2个基因LtYABBY1,5,全长分别为1 255、1 078 bp,编码了210、188 aa,生物信息学分析结果显示,两...     

毛白杨PtCDD基因5'片段的原核表达及功能分析

根据GenBank中毛白杨钙离子依赖型脱氧核糖核酸酶(PtCDD)基因序列,以毛白杨形成层区域的cDNA为模板,经PCR扩增出该基因上游637 bp的cDNA片段.将该片段与PET-30b( )载体连接,构建杨树PtCDD基因片段原核表达载体并进行表达研究,获得大量的PtCDD-(HIS)6 融合蛋白.并进一步对该蛋白进行纯化和功能检测.结果表明:PtCDD基因片段能够在大肠杆菌体内表达出具有DNase功能的蛋白,克服了因表达全酶可能强烈降解DNA所带来的不能最终获得表达产物的问题,为今后PtCDD蛋白的抗体制备以及进一步研究奠定了基础.     

中山杉407ThP5CS和Thδ-OAT的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]探究中山杉407(Taxodium mucronatum♀×T.distichum♂)(T.hybrid‘Zhongshanshan 407’)的Th P5CS和Thδ-OAT基因与植物耐旱性的关系,为落羽杉属植物抗性育种提供新的基因资源。[方法]利用RACE技术从中山杉407中分别克隆Th P5CS和Thδ-OAT基因c DNA全长,通过生物信息学手段分析预测其编码蛋白的结构和功能。基于干旱-复水试验,采用半定量和实时荧光定量技术研究中山杉407 Th P5CS和Thδ-OAT的表达特性。[结果]从中山杉407中克隆了编码P5CS和δ-OAT蛋白的基因,分别命名为Th P5CS和Thδ-OAT,其中,Thδ-OAT包含1个长度为1 494 bp的ORF,编码497个氨基酸,与樟子松(Pinus sylvestris L.)δ-OAT蛋白的序列相似性高达92%;Th P5CS包含1个长度为1 545 bp的ORF,编码514个氨基酸,与花烛属植物(Anthurium amnicola)P5CS蛋白的序列相似性为87%。半定量与定量PCR结果一致,在自然干旱和复水环境下,Th P5CS在中山杉407及其父本落羽杉(T.distichum)、母本墨杉(T.mucronatum)中均表现为先上调再下调的趋势,而Thδ-OAT在中山杉407及其父母本中相对表达量则存在差异。[结论]干旱胁迫下,Thδ-OAT和Th P5CS基因的正反方向调节是中山杉407及其亲本在干旱胁迫与恢复状态下控制脯氨酸水平的关键机制,其中,Th P5CS在中山杉407及其亲本脯氨酸的合成过程中起重要作用。     

毛白杨油酸去饱和酶基因PtFAD2的克隆与表达分析

以毛白杨为材料,结合生物信息学和分子生物学技术,利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并,获得了理论的杨树油酸去饱和酶基因PtFAD2 cDNA序列;首次利用RT-PCR方法从杨树这个物种中成功克隆得到毛白杨PtFAD2全长编码序列cDNA(GenBank注册号:DQ316788),该cDNA长1 276bp,开放阅读框编码388个氨基酸.RT-PCR半定量研究表明:PtFAD2在叶片、茎、根不同组织中的表达量基本一致,并且在4℃低温处理过程中转录表达量没有变化,说明短时间内该基因表达不受低温诱导.     

Constitutive Expression of Sense & Antisense PtAP3, an AP3 Homologue Gene of Populus tomentosa, Affects Growth and Flowering Time in Transgenic Tobacco

To analyze the function of PtAP3, an APETALA3 (AP3) homologue gene isolated from Populus tomentosa Carr., the full length sequence (1 797 bp) and a fragment (870 bp) of PtAP3 were fused to a CaMV 35S promoter of pBI121 to generate the sense and antisense constructs of PtAP3. These constructs were transformed into tobacco by Agrobacterium infection of leaf disks and selection on kanamycin medium. Some sense and antisense transgenic tobacco plants were obtained by PCR and Southern blot analysis. Great phenotypic differences in transgenic tobacco plants were observed. Almost all of sense PtAP3 to transgenic tobaccos showed a higher growth rate than those of antisense transformants and a few developed pregnancy earlier than wild type seedlings and antisense transformants under the same conditions.     

Constitutive Expression of Sense & Antisense PtAP3, an AP3 Homologue Gene of Populus tomentosa, Affects Growth and Flowering Time in Transgenic To-bacco

To analyze the function of PtAP3, an APETALA3 (AP3) homologue gene isolated from Populus tomentosa Carr., the full length sequence (1 797 bp) and a fragment (870 bp) of PtAP3 were fused to a CaMV 35S promoter of pBI121 to generate the sense and antisense constructs of PtAP3. These constructs were transformed into tobacco by Agrobacterium infection of leaf disks and selection on kanamycin medium. Some sense and antisense transgenic tobacco plants were obtained by PCR and Southern blot analysis. Great phenotypic differences in transgenic tobacco plants were observed. Almost all of sense PtAP3 to transgenic tobaccos showed a higher growth rate than those of antisense transformants and a few developed pregnancy earlier than wild type seedlings and antisense transformants under the same conditions.     

杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化

【目的】研究杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化。【方法】提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA,反转录生成 cDNA,构建接种溃疡病菌72 h 后的 SSH － cDNA 库,从库中获得 ESTs,将 ESTs 注释到Unisequences,挑选出与转录相关的Unisequences,利用RT－qPCR对转录基因作进一步的分析。随机挑选199个阳性克隆进行测序,测序结果经与 NCBI基因库中序列进行比较,发现172个 EST 同源序列,对这些 EST 在 dbEST 数据库进行同源检索分析。【结果】有10个序列与转录相关,占5．8%,分为4类,即：锌指蛋白,含EAR转录区域;类CONSTANS转录因子,编码核蛋白;普通转录因子,调节转录;WRKY21转录因子,参与防御信号转录。通过 RT －qPCR对其中3类(锌指蛋白、类 CONSTANS和 WRKY21)转录因子做进一步分析发现,Z锌指蛋白( Cys/His－rich)在接种溃疡病菌后,在诱导初期增长缓慢,48 h后逐渐升高,144 h达到最高,表达量是未接种时的50倍;WRKY21表达量先升高(12～24 h),然后降低(24～96 h),144 h 时,表达量是未接种时0.94倍;类 CONSTANS 表达量一直处于缓慢升高的趋势,直到诱导144 h,是未接种时2倍。【结论】毛白杨被溃疡病菌感染后与防御相关的转录因子表达量明显上升,这可为毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定提供理论基础。     

毛白杨PtDREB2A基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用基因特异的PCR引物由毛白杨受干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一PtDREB2A cDNA克隆,并进行测序和序列分析,结果表明:PtDREB2A cDNA片段总长为946 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为864 bp,可编码长度为287个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在AP2/ERF结构功能域与拟南芥AtDREB2A和水稻OsDREB2A蛋白的同源性分别为80.3%和83.3%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtDREB2A在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式不同:PtDREB2A在叶片表达丰度最高,在树干皮层及根部组织表达丰度中等,而在顶端分生组织及主干韧皮部、形成层与木质部表达丰度最低。非生物胁迫及激素诱导差异表达显示,PtDREB2A不仅受高温、低温、干旱与盐诱导表达,还受到激素IAA,NAA及GA3的上调表达,但与ABA的诱导无关。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨45株基因型个体的PtDREB2A序列进行比对和分析,共检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/18 bp,多样性指数π为0.0...     

毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1)的克隆及其在烟草中的遗传转化

克隆毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1),全长为3 215 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA1基因的同源性为97%,具有开放的阅读框,编码区在52～2 988碱基之间,为2 937 bp.构建PtoCesA1基因的全长正义植物表达载体为pBIPA1,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确.通过农杆菌介导的方法将pBIPA1表达载体转入烟草中,转基因植株的纤维细胞壁厚度和木质部厚度都有不同程度的下降,形态表征为植株明显变矮,叶片变小.     

毛白杨干细胞决定基因Wuschel的克隆及其单核苷酸多态性分析

Wuschel(Wus)转录因子基因在维持干细胞群数量上具有关键性的调控作用.以模式植物拟南芥Wus为信息探针,在杨树基因组中共检测到2个Wus候选基因,并设计了基因特异的引物,从毛白杨形成层cDNA中分离得到长度分别为922 bp和956 bp的2个cDNA,其分别含有编码258个和264个氨基酸残基的完整开放阅读框.所推导的蛋白质氨基酸序列在结构功能域区域分别与拟南芥Wus蛋白的同源性为76.O%和74.9%,故将其命名为PtWus1和PtWus2.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.0软件对毛白杨36株基因型个体的PtWus1和PtWus2序列进行比对和分析,分别检测到58个和51个单核苷酸多态性(SNP)位点,多样性分别为1/27 bp和1/30 bp.对于PtWus1,共检测到24个常见SNPs和34个罕见SNPs,其中43个属于转换,15个属于颠换;在外显子区域,共检测到21个SNP位点,其中16个为同义突变,4个为错义突变,1个为无义突变.而对于PtWus2,基因内部含有28个常见SNPs和23个罕见SNP,其中36个属于转换,15个属于颠换;在编码区域检测到的26个SNPs中,同义突变和错义突变均为13个.对PtWus,和PtWus2基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的.本研究为毛白杨Wus蛋白转录因子基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

AFLP标记在毛新杨&#215;毛白杨BC1群体中的分离

利用AFLP分子标记技术 ,以毛新杨×毛白杨BC1群体中的 12 0个单株为材料 ,在整个基因组水平上研究AFLP标记在该群体中期望的孟德尔分离情况 .4 1对AFLP引物组合共检测到 2 70 7个位点 ,其中在分离群体的亲本毛新杨和毛白杨间具有多态性的位点有 712个 .经卡方检验后得到在P <0 .0 1水平上 ,符合期望孟德尔 1∶1分离的位点共有 5 71个 ,占多态性位点的 80 .2 % ,该结果表明AFLP标记技术很适合用于毛白杨指纹分析和遗传连锁图谱构建