胚胎玻璃化冷冻的实验研究

用小鼠胚胎分别在甘油、丙二醇、乙二醇不同浓度比例的10组玻璃化1液中平衡,每组均分室温和低温平衡,共20个组合。研究表明,提高甘油浓度、降低丙二醇及乙二醇浓度,可明显提高玻璃化冷冻后的胚胎体外培养发育率。低温平衡优于室温平衡。15%甘油 5%丙二醇 5%乙二醇的PBS液,是较为理想的第1冷冻液组合。室温平衡的培养发育率为37.5%（18/48）,低温平衡的培养发育率为71.4%（30/42）,差异极显著（P<0.01）;采用2步低温平衡,优选上述第1冷冻液,玻璃化冷冻200枚小鼠胚胎,解冻后培养至膨胀发育率为82.5%（165/200）。     

小鼠的胚胎冷冻保存研究

随着生物工程技术的进步，出现了许多生物工程小鼠品系，促使小鼠胚胎冷冻保存技术得到了广泛的应用，采用胚胎冷冻的方法来长期的保存这些品系，可以节省大量的人力和物力，目前，在小鼠胚胎冷冻方面的研究主要是围绕提高存活率和简化操作过程，本文综述了在小鼠胚胎冷冻保存方面的国内外研究进展。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

哺乳动物胚胎玻璃化冷冻研究进展

近40年来,利用冷冻保存技术将哺乳动物胚胎长期保存起来,建立"胚胎库"是保护物种资源和拯救濒危动物的有效手段,同时也是加快家畜品种改良、建立动物基因库和实施胚胎移植产业化的重要组成部分,也可以为克隆、转基因等现代生物技术提供丰富的试验材料,使胚胎的供给不受时间和空间的限制。胚胎冷冻保存技术在人类辅助生殖方面也具有广阔的应用前景。本文主要介绍了玻璃化冷冻过程中胚胎冷冻主体承载工具特点和应用,并展望未来哺乳动物胚胎冷冻发展的方向。     

哺乳动物胚胎玻璃化冷冻方法

哺乳动物胚胎冷冻技术自建立以来,已进行了一些重大改进。其主要进展有: 1.缩短冷冻时间:提高慢速(0.3℃/分钟)降温操作的中止温度,至到较高的零下温度(-30～-40℃)或者快速降温,降到一定低温便保持此温度一段时间(两步冷冻法)。这样做虽然时间缩短了,但胚胎仍含有水分,这些水分在胚胎投入液氮的急剧降温过程中,便形成小冰晶或者不太稳定的玻璃态。因此,需快速解冻,以防止升温过程中形成有损于胚胎的冰晶。 2.缩短解冻后脱除低温保护剂时间:用非渗透剂(蔗糖)一步稀释,以避免保护剂脱出后胚胎发生渗透性膨胀。 3.玻璃化冷冻法(Vitrification):这是前不久研究出的一种新冷冻方法。其设计根据是,保护剂的稀释液在急剧降温到很低温度时,能被浓缩,而不会形成冰晶。作者已试验成功用两种浓度的低温保护剂,作为胚胎内液(10％甘油和20％丙二醇混合液)和外液(25％甘油和25％丙二醇混合液),且均能达到玻璃化。用此法冷冻的小鼠和牛的晚期桑葚胚已移植成功并产仔。     

牛胚胎玻璃化冷冻技术研究进展

胚胎冷冻保存是保存和繁殖遗传优势动物的主要工具,是胚胎移植产业的重要组成部分。目前广泛使用的冷冻方法主要有慢速冷冻和玻璃化冷冻2种。由于玻璃化冷冻具有成本低、效率高、操作简单等优点,玻璃化冷冻法越来越受到人们的重视。经过多年研究,研究人员已经在玻璃化冷冻方法、冷冻液等方面取得了大量进展,玻璃化冷冻法已经开始进入商业化应用。本文综述了牛胚胎冷冻保存技术的研究进展,旨在为相关从业人员提供一定借鉴和参考。     

猪胚胎的OPS玻璃化冷冻

以广西巴马小型猪为供体,采用超数排卵技术,采集5~6日龄具有完整透明带的胚胎(囊胚/桑葚胚),采用二步法OPS(Open pulled straw)玻璃化冷冻技术进行保存,即胚胎首先在冷冻液1(TCM199 20?S 10%EG 10%DMSO)中平衡3 min,然后立即转入冷冻液2(TCM199 20?S 20%EG 20%DMSO 0.4 mol/LSUC)中并在1 min内装管(每管含2~6枚胚胎),直接投入液氮保存;3个月后解冻移植给8头受体母猪(每头移入25~26枚胚胎),其中1头怀孕产仔(8头活仔),获得猪胚胎超低温(-196℃)冷冻后代。     

牛IVP胚胎玻璃化冷冻技术的研究

作者比较了乙二醇传统冷冻和OPS玻璃化冷冻牛IVP胚胎的效果,目的是改善其冷冻效果,提高IVP胚胎的移植妊娠率。结果表明,玻璃化冷冻后的存活率(D7-71)明显高于D7-71L(P<0.01),D7-72组与D7-71L组(传统冷冻方法)的存活率基本一致(P>0.05)。     

简单而有效的哺乳动物胚胎玻璃化冷冻方法

简单而有效的哺乳动物胚胎玻璃化冷冻方法王海彦朱士恩译１前言如果胚胎可以有效地进行冷冻保存，那么这项技术将可应用在多种哺乳动物如家畜、实验动物、野生动物以及人。然而，在胚胎冷冻和解冻过程中都存在好多会使胚胎受到损伤的因素。如：抗冻保护剂的毒性；冷冻损伤...     

小鼠4-细胞胚胎OPS法冷冻保存技术

在25℃室温和37℃恒温台条件下，利用玻璃化冷冻溶液EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40，对小鼠4-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存．以解冻后培养72h的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标，同时对解冻后培养1～3h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。开放式拉长塑料细管（OPS）二步法冷冻保存，即胚胎首先移入预处理液（10％EG或10％EG＋10％DMSO）中平衡30s，再移入玻璃化溶液中洗涤后吸入OPS管中，分别经35、30或25s后直接投入液氮中冷冻保存。一步法冷冻保存则无需预处理液处理。结果表明，小鼠胚胎4-细胞一步法和二步法冷冻后囊胚最高发育率分别为87．7％和88.6％，与对照组（93.0％）差异不显著（P〉0．05）。利用最佳冷冻组获得的143枚胚胎移植于12只假妊娠50～60h的受体母鼠，结果有4只妊娠产仔17只，妊娠产仔率为42．5％（17／40），与对照组59．4％（19／32）差并不显著（P〉0.05）。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

小鼠胚胎计数方法的研究及应用

胚胎细胞计数是评定胚胎活力,检验胚胎体外操作方案和培养效果的常用方法。实验以昆明小鼠体内发育胚胎和体外聚合囊胚为实验材料,对几种细胞的计数方法及应用进行了详细的研究。结果表明:（1）低渗压片法的实验效果最佳。（2）根据形态学观察,结合细胞计数,可以把小鼠8-细胞以后胚胎划分为:8-细胞晚期[细胞数目为（11.9±0.65）个];同一时间收集的桑椹胚和早期囊胚细胞数目相似;不同时间收集的囊胚细胞有明显差异。（3）细胞计数分析表明:8-细胞聚合胚发育形成聚合囊胚时,其细胞数目未发生调整。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带超微结构变化及体外受精效果的影响

本实验采用OPS法玻璃化冷冻小鼠卵母细胞,通过扫描电镜观察透明带表面物理特性的变化。旨在研究冷冻导致小鼠卵母细胞透明带表面超微结构的变化以及冷冻卵母细胞体外受精后胚胎发育率和精子穿透透明带能力的影响。结果表明:冷冻后透明带表面网状结构消退或消失,发生熔融样变化。冷冻组中A型透明带比例(57.14%)显著低于毒性实验组(79.32%)及对照组(81.25%)(P<0.05),而发生熔融样变化的比例显著高于其他两组(P<0.05)。体外受精后,冷冻组的卵裂率和囊胚发育率(60.90%,39.51%)均显著低于毒性实验组及对照组(81.74%,55.72%;87.47%,61.63%)。体外受精4 h,冷冻组透明带平均结合精子数(10.56)与毒性实验组和对照组(10.26,10.21)间均无显著性差异(P>0.05);但受精后对透明带消化处理发现,冷冻组紧密结合精子的平均个数(3.28)与其他两组(5.11,5.21)存在显著性差异(P<0.05)。结果显示,冷冻导致透明带表面物理特性的变化,进而造成受精率下降。     

Vitrification of mouse two-cell and blastocyst stage embryos in simplified closed system using either a hemi-straw or a hollow fiber device

Two-cell stage and blastocyst stage mouse embryos were equilibrated in a medium containing 7.5% ethylene glycol (EG) and 7.5% dimethyl sulfoxide (DMSO) for 8–15 min. Vitrification was performed in a medium containing 0.5 M sucrose and either 15% EG + 15% DMSO, 17.5% EG + 17.5% DMSO, or 20% EG + 20% DMSO for 30 s. They were then placed either on a hemi-straw (HS) or a hollow fiber vitrification (HFV) device and vitrified by cooled air inside a 0.5-ml straw. In two-cell embryos, a 100% survival rate was obtained from all groups except the 20% HS group (P > .05). All vitrified two-cell groups showed similar rates of blastocyst development to that of fresh control group (P > .05), except 17.5% and 20% HFV groups, which were significantly lower than the other groups (P < .05). In the blastocyst embryos, the HFV groups were divided into two subgroups (non-collapsed; HFV-NC and collapsed; HFV-C blastocyst). Re-expansion rate in 15% HFV-NC, 17.5% HFV-NC, and 15% HFV-C groups was reduced (P < .05), whereas the rest were similar to control. In conclusion, we established a simplified, reliable, and closed system for HFV vitrification applying hemi-straw, which does not require skilled practitioners.     

DNA Methylation Pattern in Pronuclear-Stage Mouse Embryos: Effect of Oocyte Vitrification

This study was conducted to investigate the pattern of DNA methylation in pronuclearstage mouse embryos derived from vitrified-warmed oocytes.Mouse oocytes at metaphase Ⅱ (MⅡ) stage of meiosis were all...     

哺乳动物胚胎冷冻技术研究进展

胚胎冷冻保存已广泛用于胚胎移植，动物克隆以及动物资源保护。此技术的应用需保证胚胎在冷冻一解冻后具有较高的成活率。自1972年小鼠胚胎冷冻获得成功以来，许多学者在简化冷冻程序，缩短冷冻时间等方面进行了深入研究，试图寻找一种可用于生产的冷冻方法。本文全面地比较了不同的冷冻方法及其结果，籍此为该领域工作者提供一定帮助。     

牛胚胎冷冻保存的研究进展

目前,牛的胚胎冷冻保存巳成为一种较成熟的常规技术,广泛应用于牛的繁殖科研与生产。本文回顾了牛胚冷冻保存技术的发展概况,对牛胚胎的常规冷冻技术、直接冷冻法及玻璃化冷冻技术的进展作了简要论述。