小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

普通小麦 TaCAT 9基因的克隆与表达分析

氨基酸转运蛋白是植物体内一类负责氨基酸运输的蛋白,是植物氮代谢的重要媒介。CAT9（阳离子氨基酸转运蛋白9）是氨基酸转运蛋白家族的一员,为深入了解小麦中该基因的序列特征及表达特性,采用同源克隆的方法从普通小麦品种豫麦49-198中获得TaCAT9两个部分同源基因的cDNA序列。因两基因分别位于小麦6 A和6 B染色体长臂上,故分别命名为TaCAT9-A和TaCAT9-B。生物信息学分析结果表明,两个TaCAT9基因的CDS长度均为1 818 bp,编码605个氨基酸;它们的编码蛋白等电点分别为8.23和8.27,分子量分别为64.04 kDa和64.08 kDa,属于疏水稳定蛋白。并且两蛋白均含有阳离子氨基酸转运蛋白的C末端和13个跨膜区。进化分析结果表明,小麦CAT9蛋白与乌拉尔图小麦和山羊草的CAT9蛋白亲缘关系密切。实时荧光定量反转录PCR结果表明,TaCAT9基因在根、茎、叶和籽粒中都有表达,但在叶中的表达量最高;在氮饥饿条件下,该基因的表达上调,推测该基因参与小麦低氮胁迫应答。     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

乌拉尔图小麦WOX基因的克隆与表达分析

WOX基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族,在植物的生长发育过程发挥重要作用。本研究通过同源克隆的方法,得到乌拉尔图小麦(Triticum urartu)WOX基因家族的6个成员: TuWOX1、 TuWOX2、 TuWOX3、 TuWOX4、 TuWOX5和 TuWOX3a。生物信息学分析表明, TuWOX2、 TuWOX3和 TuWOX3a属于WUS支/进化支, TuWOX4属于古老支, TuWOX5属于中间支。除这三个分支外, TuWOX1自成一支,说明在乌拉尔图小麦中可能出现了不同功能的WOX家族基因。利用qRT-PCR技术对得到的WOX基因在乌拉尔图小麦不同组织的表达模式以及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行了分析,结果表明,WOX基因在乌拉尔图小麦各组织中均有表达,但在不同组织中的表达量差异较大,说明WOX基因在不同的组织中发挥作用;非生物胁迫条件下WOX基因表达水平发生了变化,表明其可以响应外界的胁迫。     

玉米ZmCPB1基因的克隆、表达及生物信息学分析

从玉米中克隆ZmCPB1基因的cDNA序列,全长1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质理论分子量为54.05 KD,等电点为8.59。生物信息学分析表明,ZmCPB1蛋白N端有跨膜结构,是跨膜蛋白。蛋白质二级结构含有48.44%的α-螺旋、4.99%的β-转角、10.60%的延伸链以及35.97%的无规则卷曲,该蛋白定位于内质网中。序列比对结果显示,ZmCPB1蛋白含有与子粒发育相关的保守区VKFVHRKALK。系统进化树分析表明,该蛋白与高粱、谷子、水稻和大麦的同源蛋白亲缘关系最近,同属一个亚支。实时荧光定量PCR分析ZmCPB1基因的表达模式,结果表明,ZmCPB1基因在3叶期的根、茎、叶以及雄穗和苞叶中表达量较低,在雌穗中的表达量较高。在玉米子粒发育的不同时期,ZmCPB1基因的表达量呈现一定的规律变化,在授粉后0～10 d,表达量逐渐达到最高峰,之后开始下降,在授粉15 d后降到较低水平。初步判断ZmCPB1基因与玉米子粒早中期发育有关。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦 DA1基因家族成员的鉴定及其表达谱分析

泛素受体DA1在控制种子和器官大小上发挥着重要作用。本研究以中国春小麦为材料,采用生物信息学的方法对小麦 DA1基因家族成员进行了全基因组鉴定和分析,共鉴定到12个小麦 DA1同源基因（ TaDA1s）,分别位于2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色体上,亚细胞定位预测结果表明其位于细胞核中。系统进化分析发现, TaDA1s可分为 TaDA1、 TaDAR1和 TaDAR2三类。除TaDA1-2D1编码的蛋白只含有DA1-like结构域外,其他成员编码的蛋白均含有DA1-like、UIM和LIM结构域。启动子序列分析发现, TaDA1s的启动子区含有较多的响应激素、逆境以及与生长发育相关的顺式作用元件。通过公共的转录组数据和qRT-PCR试验验证, 发现 TaDA1s在不同组织中都有表达,在籽粒发育过程中,不同的小麦 DA1基因呈现不同的表达模式,暗示存在基因功能分化现象;脱落酸（ABA）能够抑制 TaDA1s的表达;在低温和盐胁迫条件下, TaDA1s基因表达有明显的差异。酵母双杂交和荧光素酶互补试验发现,TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2存在转录自激活现象,且TaDAR1-5A与TaGW2有微弱的互作效应。本研究结果为进一步探究 DA1基因家族在小麦中的生物学功能奠定了基础。     

小麦TaPYL8基因的克隆与抗旱功能分析

脱落酸(ABA)信号通路在植物对干旱胁迫的响应中扮演着至关重要的角色;作为ABA受体,PYL家族蛋白在ABA信号转导中发挥核心作用。小麦TaPYL8是PYL家族的成员。为了明确TaPYL8是否参与小麦干旱胁迫响应,本研究分析了TaPYL8的表达模式,创建过表达TaPYL8拟南芥,并探讨了干旱对拟南芥生理生化及胁迫相关基因表达的影响。结果表明,TaPYL8表达量在干旱胁迫、外源ABA及PEG6000处理后上调。干旱胁迫下,过表达TaPYL8增强了拟南芥的存活率,降低了叶片失水率和MDA含量,提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性及AtSOD、AtP5CS1、AtABF3等胁迫相关基因的表达量。推测TaPYL8通过促进胁迫相关基因表达增强植物抗旱能力。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM）,该基因的cDNA序列全长1 559 bp,包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框,编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域,属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示,HbPGAM蛋白无导肽酶切位点,不具有跨膜结构域且为亲水蛋白,该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达,但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高,且该基因在胶乳中的表达受割胶影响,推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外,HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控,但调控不明显。结果说明,胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用,为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

小麦QTL富集区 QC-4BS重要农艺性状基因的精细定位及 Rht1基因的效应分析

为了探明位于小麦4BS染色体上的一个QTL富集区 QC-4BS重要农艺性状的遗传效应,对 QC-4BS重要农艺性状基因进行了精细定位,并分析了位于 QC-4BS内的 Rht1基因对小麦株高（PH）、穗粒数（KNPS）、千粒重（TKW）、蛋白质含量（GPC）及容重（TW）等性状的遗传效应。结果表明, QC-4BS主要位于小麦4BS染色体的 IWA1846至IWA4662标记区间,长度为11.9 cM,对应的物理距离约为15.17 Mb,其中控制PH的QTL为 Rht1基因,距离IWA1846标记约7.16 Mb;控制GPC和KNPS的位点接近IWA482标记;控制TW的位点接近基因 Rht1。 Rht1基因除了具有明显的降低小麦PH的效应外,也可影响小麦的某些产量及品质性状,具体表现为增加小麦KNPS,降低TKW、GPC及TW。     

小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的鉴定及其等位变异分析

为解析小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的生物学功能,本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、 TaNRT1.1-1B和 TaNRT1.1-1D)。生物信息学分析表明,这三个同源基因编码的蛋白均为疏水蛋白,含有丰富的α-螺旋和无未见则卷曲,主要定位于质膜上。小麦不同组织qRT-PCR分析表明, TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在根中表达量最高,其次是叶和茎, TaNRT1.1-1D基因在茎中表达量最高,其次是叶和根。因此,推测 TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在硝酸盐吸收过程中发挥了重要作用, TaNRT1.1-1D基因在硝酸盐转运过程中发挥了重要作用。通过对小麦 TaNRT1.1基因多态性筛选发现,在 TaNRT1.1-1A基因启动子上游1 120 bp的位置有一个8 bp(TGCATGCA)的插入位点,该位点可能与小麦氮利用效率相关。不同氮利用效率小麦品种qRT-PCR分析结果表明,氮高效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-b）苗期根中 TaNRT1.1-1A基因的相对表达量显著高于氮低效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-a）。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。     

玉米PRC2基因在子粒发育过程中的表达分析

以玉米自交系昌7-2授粉后不同天数的玉米子粒为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术,对玉米中3个Polycomb Repressive Complex 2基因(PRC2)Mez1(Maize enhancer of zeste 1)、Fie1(Fertilization independent endosperm 1)和Vef101(VEF family protein 101)在授粉后不同天数的表达情况进行研究。结果表明,Mez1、Fie1和Vef101在授粉后子粒发育不同阶段均有表达,Fie1在子粒发育过程中呈先上升后下降的趋势,授粉后10 d表达量最高,表明Fie1可能在子粒由胚胎形成到干物质积累的过渡时期发挥调控作用;Mez1在子粒发育过程中呈先下降后上升的趋势,授粉后10 d表达量最低,子粒发育后期表达量明显上升,表明Mez1可能在子粒淀粉积累过程中发挥调控作用;Vef101只在授粉后5 d的子粒中呈现高表达,其他时期表达量均较低,表明Vef101可能在玉米子粒发育早期胚胎形成过程中发挥调控作用。     

荆州黑麦 NPR1同源基因 ScNPR1的克隆与特性分析

为了明确荆州黑麦ScNPR1基因的功能,对荆州黑麦 NPR1同源基因ScNPR1进行克隆并分析了其表达特性。利用同源序列法和RACE技术从荆州黑麦中克隆得到 NPR1同源基因的3 185 bp全长cDNA序列,该基因包含了一个编码507个氨基酸(1 524 bp)的开放阅读框、终止密码子TGA、5′端1 517 bp的非编码区和3′端144 bp的非编码区,命名为ScNPR1。利用生物信息学软件对其结构进行分析,ScNPR1编码的氨基酸序列与已知的小麦、水稻 NPR1基因编码的氨基酸序列具较高的同源性,分别达到92.4%和90.3%。荧光定量PCR发现,ScNPR1基因在小麦不同器官中均有表达,在叶、茎、根中表达较高;ScNPR1基因在植物抗病相关信号分子水杨酸、茉莉酸和乙烯处理后上调表达,在白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌的诱导下,ScNPR1基因也上调表达。研究结果表明,ScNPR1基因与水杨酸和乙烯信号转导途径有关,参与寄主对病原菌侵染的防御反应。     

玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析

利用水稻雄性不育相关基因Osms1同源克隆玉米中的同源基因Zmms1,用生物信息学方法对水稻Osms1及玉米Zmms1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,水稻雄性不育相关基因Osms1编码区长度为2 232 bp,编码679个氨基酸,Zmms1编码区长度为2 461 bp,编码670个氨基酸。通过对ms1蛋白功能结构域进行分析发现,Zmms1和Osms1同为PHD-ZF超家族成员,二者具有相同的功能结构域和近似的三级结构,因此推测,Zmms1可能与Osms1具有相似的功能。