小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

普通小麦 TaCAT 9基因的克隆与表达分析

氨基酸转运蛋白是植物体内一类负责氨基酸运输的蛋白,是植物氮代谢的重要媒介。CAT9（阳离子氨基酸转运蛋白9）是氨基酸转运蛋白家族的一员,为深入了解小麦中该基因的序列特征及表达特性,采用同源克隆的方法从普通小麦品种豫麦49-198中获得TaCAT9两个部分同源基因的cDNA序列。因两基因分别位于小麦6 A和6 B染色体长臂上,故分别命名为TaCAT9-A和TaCAT9-B。生物信息学分析结果表明,两个TaCAT9基因的CDS长度均为1 818 bp,编码605个氨基酸;它们的编码蛋白等电点分别为8.23和8.27,分子量分别为64.04 kDa和64.08 kDa,属于疏水稳定蛋白。并且两蛋白均含有阳离子氨基酸转运蛋白的C末端和13个跨膜区。进化分析结果表明,小麦CAT9蛋白与乌拉尔图小麦和山羊草的CAT9蛋白亲缘关系密切。实时荧光定量反转录PCR结果表明,TaCAT9基因在根、茎、叶和籽粒中都有表达,但在叶中的表达量最高;在氮饥饿条件下,该基因的表达上调,推测该基因参与小麦低氮胁迫应答。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

偃麦草ErABF1基因克隆及功能分析

抗逆相关bZIP (Basic leucine zipper) 转录因子家族基因主要参与ABA、干旱、高盐等胁迫应答反应,其过表达能够显著增强植物的抗逆性。本研究从偃麦草（Elytrigria repens L.）中分离到一个抗逆相关 ErABF1（E. repens ABA Binding Factor 1）基因,氨基酸序列比对分析发现,该基因与小麦、玉米、拟南芥等bZIP转录因子基因同源性较高,亲缘关系较近;ErABF1基因的表达受到ABA、干旱、高盐、低温的强烈诱导;在2% PEG、200 mmol·L^-1 NaCl胁迫培养基上初步功能分析表明, ErABF1过表达提高了转基因烟草对干旱、高盐的胁迫耐性。     

小麦TaWRKY2基因组分析及在进化和育种材料中的检测

小麦WRKY转录因子在抗旱抗逆等方面有重要作用。为小麦抗旱抗逆分子模块组装育种提供参考,本研究在已有小麦TaWRKY2基因cDNA序列（GenBank登录号：EU665425）的基础上,从小麦品种晋麦79号中克隆获得TaWRKY2基因全长序列,并对TaWRKY2的基因结构、基因组信息进行研究,同时检测其在部分小麦亲缘种、黄淮麦区水旱地代表品种、本课题组选育的高代品系及部分水旱地杂交组合F₁代中的分布。结果表明,克隆所得到的TaWRKY2基因全长DNA序列包含4个外显子和3个内含子,其中,3个内含子长度变化范围为111~172 bp;外显子和内含子的交接处序列符合GT-AG原则;与乌拉尔图小麦（Triticum urartu,AA）和粗山羊草（Aegilops tauschii,DD）中的片段序列同源性分别为93%和99%,与中国春小麦（AABBDD）1AS、1BS和1DS染色体的片段序列同源性分别为93%、88%和99%。除野生一粒小麦外,在小麦进化祖先种、黄淮海水旱地推广的代表品种、课题组选育的高代品系及F₁代共78份材料中,都能够检测出该基因的普遍存在,说明该基因可应用于小麦抗旱抗逆分子设计育种中。     

小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析

磷脂酶D (Phospholipase D,PLD) 是植物体内重要的信号转导酶。为了深入了解小麦PLD基因功能,利用同源克隆的方法从普通小麦扬麦158中克隆出TaPLDδ基因后进行序列分析,同时对TaPLDδ基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,TaPLDδ基因编码区长为2 589 bp,编码862个氨基酸,等电点为6.93,分子量约为97 kDa。氨基酸序列分析显示,TaPLDδ基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及两个保守的HKD活性中心。预测分析表明,TaPLDδ蛋白属于亲水性稳定蛋白,在细胞质中合成后,不进行蛋白转运;其二级结构包含27.49%的α-螺旋、19.14%的延伸链、6.73%的β-转角和46.64%的不规则卷曲。不同物种间TaPLDδ蛋白的同源性分析比较表明,TaPLDδ与谷子、玉米和拟南芥的PLDδ氨基酸序列之间具有高度的保守性,且与乌拉尔图小麦、二穗短柄草和水稻PLDδ亲缘关系密切。此外,qRT-PCR分析表明,TaPLDδ在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、NaCl和PEG诱导表达增强,推测该基因参与小麦渗透胁迫应答。以上这些研究结果为进一步研究TaPLDδ的生物学功能奠定了基础。     

小麦QTL富集区 QC-4BS重要农艺性状基因的精细定位及 Rht1基因的效应分析

为了探明位于小麦4BS染色体上的一个QTL富集区 QC-4BS重要农艺性状的遗传效应,对 QC-4BS重要农艺性状基因进行了精细定位,并分析了位于 QC-4BS内的 Rht1基因对小麦株高（PH）、穗粒数（KNPS）、千粒重（TKW）、蛋白质含量（GPC）及容重（TW）等性状的遗传效应。结果表明, QC-4BS主要位于小麦4BS染色体的 IWA1846至IWA4662标记区间,长度为11.9 cM,对应的物理距离约为15.17 Mb,其中控制PH的QTL为 Rht1基因,距离IWA1846标记约7.16 Mb;控制GPC和KNPS的位点接近IWA482标记;控制TW的位点接近基因 Rht1。 Rht1基因除了具有明显的降低小麦PH的效应外,也可影响小麦的某些产量及品质性状,具体表现为增加小麦KNPS,降低TKW、GPC及TW。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现,小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达,并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32,但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析,然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作,并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料,利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明, TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近,且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明,TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因,发现该基因沉默后,小麦植株对缺钾胁迫更为敏感,植株生长受到抑制,干重显著降低,丙二醛(MDA)含量显著提高;缺钾胁迫处理下,沉默 TaHIPP32基因的植株中, TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制,且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低,说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

蔗糖合成酶(SUS)基因的SNP标记开发及其与淀粉性状的关联分析

通过直接测序法获得玉米亲本(H21和紫糯96-619)sus1基因全长序列并进行亲本间序列比对,得到120个SNP位点,通过高分辨率熔解曲线(HRM)对300个近等基因系H21 BC5F2:3进行SNP位点分型,并将后代的基因型与群体的直链淀粉含量和淀粉糊化特性进行关联分析。结果表明,marker 31与直链淀粉含量和淀粉崩解值、峰值时间、糊化特性均连锁紧密;marker 17与直链淀粉含量和淀粉的峰值时间、淀粉最终黏度均连锁紧密;marker12与直链淀粉含量、淀粉的峰值时间连锁紧密。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析

利用水稻雄性不育相关基因Osms1同源克隆玉米中的同源基因Zmms1,用生物信息学方法对水稻Osms1及玉米Zmms1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,水稻雄性不育相关基因Osms1编码区长度为2 232 bp,编码679个氨基酸,Zmms1编码区长度为2 461 bp,编码670个氨基酸。通过对ms1蛋白功能结构域进行分析发现,Zmms1和Osms1同为PHD-ZF超家族成员,二者具有相同的功能结构域和近似的三级结构,因此推测,Zmms1可能与Osms1具有相似的功能。     

乌拉尔图小麦WOX基因的克隆与表达分析

WOX基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族,在植物的生长发育过程发挥重要作用。本研究通过同源克隆的方法,得到乌拉尔图小麦(Triticum urartu)WOX基因家族的6个成员: TuWOX1、 TuWOX2、 TuWOX3、 TuWOX4、 TuWOX5和 TuWOX3a。生物信息学分析表明, TuWOX2、 TuWOX3和 TuWOX3a属于WUS支/进化支, TuWOX4属于古老支, TuWOX5属于中间支。除这三个分支外, TuWOX1自成一支,说明在乌拉尔图小麦中可能出现了不同功能的WOX家族基因。利用qRT-PCR技术对得到的WOX基因在乌拉尔图小麦不同组织的表达模式以及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行了分析,结果表明,WOX基因在乌拉尔图小麦各组织中均有表达,但在不同组织中的表达量差异较大,说明WOX基因在不同的组织中发挥作用;非生物胁迫条件下WOX基因表达水平发生了变化,表明其可以响应外界的胁迫。     

玉米COBRA基因家族分析及重要成员ZmCOBL03基因编辑

利用生物信息学的方法分析玉米COBRA家族10个成员的序列特征、与其他物种的进化关系和组织特异性表达模式。结果表明,10个COBRA家族基因都含有CCVS保守结构域,并且均定位于细胞膜上。系统进化分析结果显示,该家族可以分为2个亚族,每个亚族内的基因具有相似的基因结构和理化性质。以ZmCOBL03为候选基因开展基因编辑,采用双靶标位点的设计思路,利用农杆菌介导的玉米遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得ZmCOBL03基因靶向突变的玉米株系。表型分析证实,ZmCOBL03基因突变后严重影响了玉米的正常发育,表现为植株极端矮化且生殖生长受到抑制,证实ZmCOBL03基因在植物细胞壁纤维素合成中发挥重要作用。     

小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性研究

小麦磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC,简称PI-PLC）在小麦抗逆过程中具有重要作用。为研究 TaPLC1基因与小麦耐热性的关系,选用热敏感型品种中国春(CS)和耐热型品种TAM107,在一叶一心期用PI-PLC抑制剂U73122处理,在两叶一心期进行40 ℃热胁迫处理,对小麦植株的部分生理指标（MDA、SOD、叶绿素和可溶性糖含量）及 TaPLC1基因的表达模式进行测定。结果表明,在两个品种中,抑制剂处理较未处理的幼苗叶片MDA、SOD及可溶性糖含量均升高,叶绿素含量下降,中国春的变化幅度大于TAM107。 TaPLC1基因在两个品种中呈现不同的表达模式,但表达量均在热胁迫30 min达到最大值。随着热处理时间的延长,未经抑制剂处理的TAM107叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度明显大于处理叶片,抑制剂处理的TAM107对热胁迫响应不显著;而未经抑制剂处理的中国春叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度与抑制剂处理的叶片差异不显著,均在一定程度上响应热胁迫;未经抑制剂处理的叶片,TAM107中 TaPLC1表达量的变化幅度明显大于中国春。热胁迫后,中国春幼苗出现明显萎蔫现象,TAM107轻微萎蔫,停止热胁迫后,全部幼苗萎蔫逐渐恢复,而抑制剂处理的幼苗叶尖开始枯萎变黄,热胁迫处理4 h后第5天表型较为明显,品种之间枯萎变黄程度无明显差异。以上结果说明,抑制 TaPLC1基因的表达后,幼苗对热胁迫的敏感性增强,TAM107和中国春的耐热性可能与 TaPLC1的表达有关。     

小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的鉴定及其等位变异分析

为解析小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1的生物学功能,本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦硝酸盐转运蛋白基因 TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、 TaNRT1.1-1B和 TaNRT1.1-1D)。生物信息学分析表明,这三个同源基因编码的蛋白均为疏水蛋白,含有丰富的α-螺旋和无未见则卷曲,主要定位于质膜上。小麦不同组织qRT-PCR分析表明, TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在根中表达量最高,其次是叶和茎, TaNRT1.1-1D基因在茎中表达量最高,其次是叶和根。因此,推测 TaNRT1.1-1A和 TaNRT1.1-1B基因在硝酸盐吸收过程中发挥了重要作用, TaNRT1.1-1D基因在硝酸盐转运过程中发挥了重要作用。通过对小麦 TaNRT1.1基因多态性筛选发现,在 TaNRT1.1-1A基因启动子上游1 120 bp的位置有一个8 bp(TGCATGCA)的插入位点,该位点可能与小麦氮利用效率相关。不同氮利用效率小麦品种qRT-PCR分析结果表明,氮高效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-b）苗期根中 TaNRT1.1-1A基因的相对表达量显著高于氮低效小麦品种（基因型为 TaNRT1.1-1A-a）。     

Ae1-5180高直链淀粉玉米近等基因系农艺性状与子粒品质分析

高直链淀粉玉米品种选育具有广阔的应用前景和商业价值,目前,我国高直链淀粉玉米种质稀缺。显性Ae1-5180突变基因为直链淀粉扩充者ae的等位突变,对其育种应用研究鲜少报道。以10组优质玉米自交系及其Ae1-5180近等基因系为试验材料,通过对植株农艺性状和子粒品质分析发现,与对照相比,全部Ae1-5180近等基因系直链淀粉含量显著提高,同时总淀粉及百粒重降低。近等基因系CA240/Ae1和CANS-1/Ae1直链淀粉含量高,且百粒重较高,农艺性状变化小,推测具有较高的潜在育种价值。     

玉米蜕皮激素合成酶基因ZmCYP92A1的克隆和表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从玉米中克隆ZmCYP92A1,GenBank登录号为KY270496.1。该基因全长1 713 bp,开放阅读框为1 551 bp,编码517个氨基酸。预测ZmCYP92A1蛋白分子量为58.58 kD,理论等电点为6.44,存在2个跨膜结构域,1个信号肽,有1个P450保守结构域。多序列比对表明,ZmCYP92A1蛋白与其他物种的CYP92A1蛋白具有极高的相似性。系统发生分析揭示,CYP92A1蛋白与属于CYP75亚家族的类黄酮3-单加氧酶的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果发现,非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)均诱导ZmCYP92A1基因的表达,表明该基因参与植物抵御非生物胁迫。     

青稞 HVA1和 blt4.9基因对模拟水分胁迫的响应差异及其在抗旱育种中的应用

为了解青稞 HVA1和 blt4.9基因在抗旱方面的作用及其差异,以青稞品种昆仑12号为材料,利用RT-PCR从8个候选内参基因( DHN1、 GAPDH、 Actin-1、 Actin-2、 18SrRNA-1、 18SrRNA-2、 TC139057和 PKABA)中筛选出在15%PEG模拟水分胁迫下表达稳定的基因,同时以筛选到的稳定表达的基因为参照,采用qRT-PCR技术研究青稞 HVA1基因和 blt4.9基因在模拟水分胁迫条件下的表达差异及在不同抗旱性青稞品种鉴定中的应用。结果表明:(1)筛选到1个在干旱胁迫下青稞叶片中能稳定表达的内参基因 TC139057;(2)在1%～30%PEG模拟干旱胁迫下,随着胁迫时间的延长,青稞 HVA1和 blt4.9基因表达量呈先增后降趋势,25%PEG处理下表达量最高,且在较低浓度PEG处理下基因表达量为 HVA1 blt4.9,而在较高浓度PEG处理下反之;(3)15%PEG处理1～144h,两基因表达量也呈先增后降趋势,胁迫48h后 HVA1基因表达量最高,胁迫96h后 blt4.9基因表达量最高,且处理前期基因表达量为 HVA1 blt4.9,后期反之;(4) 1～500μmol·L~(-1) ABA处理下,两基因表达量仍呈先增后降趋势, HVA1基因比 blt4.9基因敏感,且在较低ABA浓度下基因表达量为 HVA1 blt4.9,在较高浓度下反之;(5)获得转青稞 HVA1和 blt4.9基因拟南芥植株,其主要抗旱性生理指标优于野生型;且在较轻胁迫下,转 HVA1植株的生理指标优于转 blt4.9植株,而在较重胁迫处理下情况相反;(6)在模拟水分胁迫下,青稞叶片中两基因的表达量,抗旱性强的显著高于抗旱性弱的材料(P0.01),且较轻胁迫下 HVA1基因较敏感,反之 blt4.9基因敏感。本研究结果为 HVA1和 blt4.9基因在青稞抗旱育种中的应用奠定了基础。     

陕西小麦 Glu A3和 Glu B3位点等位变异的检测和分析

低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）与小麦品质密切相关。为了给陕西小麦的品质改良提供参考依据,采用STS分子标记,检测了175份陕西小麦品种（系） GluA3和 GluB3位点的等位变异组成。结果表明,陕西小麦 GluA3位点存在4种等位变异,即 GluA3a、 GluA3b、 GluA3c和 GluA3d,分别占12.6%、1.7%、58.3%和27.4%; GluB3位点存在8种等位变异,即 GluB3a、 GluB3b、 GluB3d、 GluB3e、 GluB3f、 GluB3g、 GluB3i和 GluB3j,分别占4.6%、2.9%、45.7%、0.6%、2.9%、8.5%、4.0%和30.8%。在陕西不同地区小麦之间,两个位点等位变异的种类、组合及其分布比例存在差异,这可能与地区间不同的自然地理环境、饮食习惯、育种目标及亲本选择有关。