柑橘溃疡病致病基因PthA核定位信号肽抗血清制备及其抑菌的研究

用PCR法扩增位于柑橘溃疡病菌致病基因pthA C-末端的3个核定位信号序列，并将其克隆到原核表达载体PET32a(+)上，经双酶切及核酸序列测定重组质粒(PthA-NLS)，其序列与GenBank中pthA的相关序列有99.9%的同一性。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导了重组多肽的表达，并用Ni2+-NTA纯化柱得到了48kD的纯化重组多肽。把重组多肽注入免疫Balb/c小白鼠，制备了相应的抗血清，Western Blotting和ELISA分析结果表明，抗血清可特异地结合重组多肽，亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白，获得的抗血清可以用于柑橘溃疡病的检测。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片，发现抗血清能推迟溃疡病菌的致病过程，且病斑比对照小，但未能达到抗病的程度。pthA基因末端核定位信号序列的克隆、原核表达及抗血清的制备为进一步研究pthA的致病机理和研发溃疡病快速分子检测技术奠定了基础。     

四川省猕猴桃病毒A外壳蛋白基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

【目的】研究猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)的发生及其多样性,为我国猕猴桃产业中AcVA病毒的快速检测、科学防控以及猕猴桃品种选育提供科学依据。【方法】通过巢式PCR从四川省猕猴桃感病叶片中扩增AcVA CP基因序列,进行序列分析和同源性比对;构建AcVA CP基因的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后制备抗血清,用Western blot检测效价。【结果】克隆到3个AcVA四川分离株的完整CP基因序列,成功构建了pET28a-AcVA-DJY4-CP重组质粒,原核表达目的蛋白并制备出特异性抗血清,效价达到1∶5 000。【结论】首次获得了3个AcVA四川分离株,丰富了AcVA的序列多样性,并探索了原核表达的最佳条件,制备了高效价抗血清,为今后AcVA病毒的快速检测和防控提供了技术支撑。     

柑橘黄龙病菌分泌蛋白05150的筛选、原核表达及抗血清制备

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业的头号杀手,其病原主要是韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas),为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,为深入研究该病菌分泌蛋白的功能,笔者筛选其中1个分泌蛋白,进行原核表达并制备抗体。【方法】设定4点条件从Prasad等预测的166个分泌蛋白基因中筛选,与pET-28a构建重组表达载体,以原核表达的融合蛋白作为抗原,用于注射兔子,制备多克隆抗体。【结果】从预测的166个分泌蛋白基因中筛选出05150基因,成功构建表达载体pET-28a-05150,表达菌株pET-28a-05150在18℃、0.1 mmol·L~(-1) IPTG浓度条件下诱导的目的蛋白为包涵体。获得的pET-28a-05150抗血清通过ELISA效价为1∶4 000,通过dot ELISA检测手段可与田间感病样品发生显色反应,通过Western blot能与融合蛋白杂交出特异性条带。【结论】该研究筛选了CLas的分泌蛋白基因05150,以其体外表达蛋白制备了pET-28a-05150抗血清,为研究05150基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学检测手段及探究柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选方法提供参考。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

 利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因（PLRV-CP）,回收大小约630 bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627 bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52 ~ 177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10（pBAD-LRCP-126）,获得了34 kD的诱导表达的融合蛋白（重组CP）。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12 800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)外壳蛋白(CP)为抗原制备抗血清的方法,从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达,分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后,分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测,同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带,以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清,该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测,2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。     

柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

香蕉线条病毒衣壳蛋白功能域基因的原核表达及抗血清制备

 制备香蕉线条病毒广东分离物（BSV-GD）的抗血清,可为BSV-GD 的快速检测和进一步研 究BSV 编码蛋白的功能提供条件。通过常规分子生物学方法,克隆了BSV-GD 衣壳蛋白（Coat protein, CP）功能域基因,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CP,并诱导表达了大小约为46.5 kD 的融合蛋 白His-CP。可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在。利用His 标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯 化、回收,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫健康大耳白兔,成功制备了BSV-GD CP 功能域基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting 分析表明该抗血清具有很强的特异性,间接ELISA 法检测抗血清效价达204 800 倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1︰1 600 ~ 1︰6 400。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

香蕉果实转录因子MaWRKY1基因的原核表达和多克隆抗体制备

MaWRKY1是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能,制备了MaWRKY1多克隆抗体。选取MaWRKY1基因全长中N端第168 ~ 400个氨基酸之间的包括两个WRKYGQK保守域的cDNA序列,构建了原核表达载体pET-MaWRKY1,并转化到大肠杆菌BL21中诱导表达菌体蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果表明,His-MaWRKY1融合蛋白成功获得了高效表达,分子量在26 kD左右。His-MaWRKY1融合蛋白经过Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5 mg • mL-1。经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清,采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA）和蛋白质印迹（Western blot）分析,表明所制备的抗体具有很好的效价,效价比为1︰160 000,同时具有良好的灵敏度和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白,Western blot检测显示,在分子量26 kD左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗体可以与香蕉WRKY蛋白特异性结合,并且低温可以诱导香蕉果实中MaWRKY1蛋白表达,暗示MaWRKY1蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。     

欢迎订阅2006年下列期刊

AIM: To construct prokaryotic expression vector of His-tagged human IP-10 for further study of its biological function in the inflammatory response. METHODS: The coding sequence of IP-10 lacking signal peptide was amplified from human lung cDNA library by polymerase chain reaction (PCR) and the fragment was cloned into pET-14b plasmid for the construction of His-tagged fusion protein expressing vector, pET-14b/IP-10. After being identified by enzyme digestion and sequencing, the recombinant vector was transformed into a strain of E. coli, BL21 (DE3). The expression of His-tagged fusion protein was induced with IPTG and purified with Ni+-NTA affinity chromatography. Then the chemotactic activity of IP-10 was determined by transwell migration assay on THP-1 cells. RESULTS: The construction of pET-14b/IP-10 recombinant vector was proved by enzyme digestion and sequencing. The fusion protein IP-10, which was purified by a routine Ni+ affinity method, had an activity on the induction of cell migration of THP-1. CONCLUSION: We successfully construct IP-10 fusion protein expressing vector and get the fusion protein with high bioactivity, which provides essential materials for the future studies on IP-10. V     

Cloning of hCD154 gene from human activated peripheral blood mononuclear cell and expression of hCD154-GST fusion protein in prokaryote

AIM:To express recombinant hCD154-GST fusion protein, to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, and to investigate the effect of anti-hCD154 monoclonal antibody on graft rejection. METHODS AND RESULTS: Total RNA was prepared from human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activated with 10ng/mL PMA and 1 μg/mL PHA for 8h, the total RNA was reversetranscribed to cDNA. The entire coding region and a part of the 3'non-coding regions were amplified by PCR using a pair of primers designed and synthesized according to the sequence of human CD154 gene from gene bank. The amplified product, a 820bp DNA fragment was cloned into pGEX-4T-1 plasmid expressing glutathione S-transferase(GST). The cloned insert was identified by double digestion of the cloned pGEX-4T-1 plasmid with retriction enzymes BamHⅠand EcoRⅠ.The fusion protein expression plasmid of PGEX-4T-1/hCD154 was constructed, then transformed to E coli BL21. The human CD154-GST fusion protein expression was induced by IPTG in BL21. The expression of recombinant 26kD GST and 55kD human CD154-GST fusion protein were confirmed by SDS-PAGE. CONCLUSION: We have express the recombinant human CD154-GST fusion protein. The expressed hCD154-GST fusion protein will be used to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, to investigate the role of anti-CD154 monoclonal antibody on graft rejection.     

筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备

以筇竹（Qiongzhuea tumidinoda Hsueh et Yi）叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a（+）上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2（DE3）菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25 kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的DNA片段.以pET32a（＋）为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0.经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21 （DE3）pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况.表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2＋-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法（ID-ELISA）测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1：25000.     

Preparation of recombinant PTD-HSP27 and verification of its ability to penetrate the cell membrane of human lens epithelial cells and rabbit cornea

AIM: To construct the prokaryotic expression system containing protein transduction domain (PTD) with heat shock protein 27 (HSP27) in order to prepare and purify the recombinant protein, and to verify whether the recombinant protein PTD-HSP27 has the ability to penetrate the human lens epithelial cell (HLEC) membrane and the rabbit cornea. METHODS: The plasmid pKYB-PTD-HSPB1-6His was constructed by the technique of overlap extension PCR. The plasmid was transformed and PTD-HSP27 was purified through nickel affinity chromatography column and identified by Western blotting. PTD-HSP27-6His was labeled with the fluorescein isothiocyanate (FITC). The penetrating ability of PTD-HSP27 into HLECs and rabbit cornea was tested. RESULTS: The recombinant PTD-HSP27 plasmid was successfully cloned and effectively expressed. The correctness of the recombinant protein PTD-HSP27 was demonstrated. Fluorescence microscopic examination showed that PTD-HSP27-FITC was internalized by HLECs. Fluorescent labeled PTD-HSP27 was then observed in the rabbit aqueous humor. CONCLUSION: The recombined gene PTD-HSPB1 was constructed by overlap extension PCR technique and the PTD-HSP27 fusion protein was prepared and purified by nickel affinity chromatography column. Using the technique of PTD-fusion protein, HSP27 was transduced into HLECs and passed through the cornea.