巴东木莲DNA的提取及SRAP-PCR反应体系的正交优化止父优化

研究确定了提取巴东木莲基因组DNA的方法．采用正交试验设计法对影响SRAP—PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量、Mg^2＋和dNTPs浓度及PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了比较、优化,同时对DNA模板浓度进行了筛选。结果表明,Mg^2＋、dNTPs、砌酶及引物的不同水平均对PCR反应结果有显著的影响。建立了巴东木莲20μL SRAP—PCR的反应体系为1xbuffer、Mg^2＋浓度为2．0mmol·L^-1、dNTPs浓度为0．25mmol·L^-1、引物浓度为0．45μmol·L^-2、Toq酶为O．5U和模板DNA40ng。适宜的扩增程序为94℃预变性1min,94℃变性1rain,33℃复性1min,72℃延伸1min,10个循环;94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72℃延伸5min。试验表明,该体系重复性好、稳定性强．     

不同浓度钙处理对枇杷小苗叶片细胞超微结构及叶绿体色素含量的影响

以CaCl2作为钙源,进行枇杷小苗钙营养液沙培试验,结果表明：0．4mmol·L^-1钙处理的枇杷小苗叶片细胞结构保持完好,细胞器形态比较清晰,0．01mmol·L^-1和3．2mmol·L^-1钙处理的枇杷小苗叶片线粒体、叶绿体等细胞器及细胞壁都受到不同程度的破坏,被膜不清晰;与0．4mmol·L^-1钙处理相比,0．01mmol·L^-1和3．2mmol·L^-1钙处理的叶绿素含量较小,叶绿素a／b值较大,叶绿素和类胡萝卜素含量与0．4mmol·L^-1钙处理间差异都达到显著水平,但0．01mmol·L^-1和3．2mmol·L^-1钙处理间的差异不显著。     

马铃薯致病疫霉EST—SSRPCR反应体系的优化

由致病疫霉（Phytophthora infestans Montagne de BaT）引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06—23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST—SSR PCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为：25ng模板DNA,0．5mmol·L^-1。dNTPs,2μL 10×Buffer（Mg^2＋ Free）,1．75mmoL·L^-1 MgCl2,15pmol引物,1．2U Tap DNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST—SSR PCR反应体系稳定、可靠．适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化

为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg²⁺、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl₂2.0 mmol·L^-1、dNTP 0.2 mmol·L^-1、引物0.2μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。     

亚麻RAPD的反应体系优化及引物筛选

对亚麻RAPD反应条件进行了优化：在25μL反应体系中,含10×Buffer,Mg^2＋（1mmol·L^-1）,Taq酶1U,Ge-nome DNA 50ng,dNTP0．25mmol·L^-1,RAPD primer 1．5／μmol·L^-1。PCR反应程序为：94℃预变性4min;94℃变性40s,37℃退火1min,72℃延伸90s。40个循环;72℃延伸10min。同时利用3个有代表性的亚麻品种从70条引物中筛选出12条多态性好、重复性高的引物,为亚麻的分子鉴定奠定了基础。     

观赏海棠SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

以观赏海棠叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2＋、dNTP、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶5种因素4个水平,对观赏海棠的SRAP反应体系进行了研究,建立了观赏海棠的SRAP最佳反应体系,结果表明,观赏海棠SRAP-PCR最佳反应体系为：Mg^2＋ 2.50mmol·L^-1、dNTP0.2mmol·L^-1、引物0.4μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶2U、10ng模板DNA,总体积为25μL。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以dNTP浓度的影响最大,模板浓度的影响最小。运用该体系对观赏海棠4个种进行验证,证明该体系稳定可靠,并从70个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行观赏海棠的分子遗传学研究提供了科学的依据。     

非洲菊再生体系的建立

以非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）大红花品种花托为外植体,选用MS为基本培养基,附加激素6-BA、NAA和IBA,研究了不同激素浓度组合对外植体愈伤诱导及不定芽分化的影响。结果表明,诱导愈伤时。MS＋6．BA 10mg·L^-1＋NAA0．5mg·L^-1＋蔗糖30g·L^-1 ＋琼脂5．5g·L^-1的效果最佳,培养30d后转接到MS＋6-BA2．0mg·L^-1＋NAA1mg·L^-1＋AD（硫酸腺嘌呤）5mg·L^-1＋蔗糖 30g·L^-1＋琼脂5．5g·L^-1的培养基上诱导芽的分化。增殖培养以MS＋6-BA2．0mg/L＋NAA0．5mg·L^-1＋蔗糖30g·L^-1＋琼脂5．5g·L^-1为佳。生根培养是以1／2MS＋IBA0．2mg·L^-1＋蔗糖30g·L^-1＋琼脂5．5g·L^-1的培养基最好。     

正交设计优化茄子SSR反应体系

以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化

为了对影响银杏戗ngkobiloba简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）扩增反应体系的因素进行优化,采用[SSR-PCR扩增技术和UVP凝胶电泳成像技术对模扳DNA浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等因素进行筛选和优化筛选优化后的反应条件：Taq酶0．3μg,2μL10×Buffer（含15mmol·L^-1 MgCl2）,模板DNA40ng,dNTP0．2mmol·L^-1,引物0．5μmol·L^-1,Mg^2＋,5nmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃变性5min,然后进行38个循环：94℃变性30S,48～53℃（根据引物而定）退火30s,72℃延伸1min;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。上述反应条件可广泛应用于银杏的遗传多样性分析、遗传育种和转基因等方面的研究。图6表1参19     

菠菜性别相关RAPD分子标记体系的建立与优化

分别以菠菜雌、雄成株的幼嫩叶片为材料,以改良的2×CTAB法提取基因组DNA,建立与菠菜性别分化相关的RAPD分子标记体系,就其PCR扩增条件与因素进行筛选与优化。即在25μl PCR反应体系中含：模板DNA200ng、引物0．32μmol／L、Mg^2＋ 2．1 mmol／L、dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1．5U。PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,36℃复性45S,72℃延伸90s,40个循环;最后72℃延伸7min。