香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因的多重PCR检测技术研究

本研究目的是建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)的技术。气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌重要的毒力因子。多重PCR技术被应用于检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本,包括鲤鱼片,水,鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片。该研究使用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16srRNA基因(356个碱基对)。所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因 (130个碱基对)。26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究

气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌的重要毒力因子。为建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)的技术,本文采用多重PCR技术检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本(包括鲤鱼片、水、鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片),并用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。结果表明,所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16S rRNA基因(356个碱基对),所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因(130个碱基对),26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

通过RS选择性培养基和针对16S rDNA与气溶素基因的双重PCR检测技术,对采集于辽宁省不同地区、不同鱼类、不同症状病鱼感染的嗜水气单胞菌进行了系统的流行病学调查,并对致病性嗜水气单胞菌进行了毒力验证试验及对抗菌药物的敏感性试验。结果发现,51株临床样本中有26株分离菌扩增得到685 bp大小的目的片段,证明为嗜水气单胞菌,占分离细菌总数的50.98%,占绝对的优势,其中以出血症状为主的病鱼分离的菌占23.99%,以肠炎为主症状的病鱼分离菌占17.99%,以烂鳃症状为主病鱼分离菌占9%。26株嗜水气单胞菌中有17株同时扩增出252 bp大小的气溶素基因(aerA),表明这17株分离菌为致病性嗜水气单胞菌。人工感染试验结果表明,致病性嗜水气单胞菌均有毒力且毒力大小差异明显。药敏实验结果显示,嗜水气单胞菌不同分离株对抗生素的敏感性差异很大,对先锋V耐药率高达90%,对新生霉素、红霉素、利福平、四环素耐药率也相对较高,分别为56.2%,42.7%,37.5%,31.1%,而对氟哌酸、链霉素、庆大霉素则较敏感。该结果对建立片区病原库,揭示辽宁地区淡水养殖鱼类感染的嗜水气单胞菌的地理分布、毒力大小、耐药性差异,进而弄清嗜水气单胞菌的表型、基因型差异具有重要理论参考意义。     

MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

以嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB（Minor Groove Binder）探针,Aero基因探针5’端用FAM基团标记,3’端用TaqMan—MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1．25×10^0CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5％,批内差异小于3％。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测

从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。     

养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离、毒力分析及ERIC-PCR分型

为对辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus(L.)全年感染嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila情况进行调查,通过细菌16S rRNA基因序列分析,以及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因的双重PCR扩增对分离株进行鉴定。结果表明:调查中共分离到7株嗜水气单胞菌(AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503),且均含有气溶素基因(aer A);ERIC-PCR结果进一步显示,7株嗜水气单胞菌存在独立基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中Ⅰ型分离株中有3株来自绥中,1株来自兴城,Ⅱ型分离株3株均来自兴城;人工感染试验显示,7株嗜水气单胞菌均具有强致病性,致病率为100%。本研究结果可为养殖大菱鲆的临床诊断以及疾病防控提供理论依据。     

鳄鱼源气单胞菌的毒力基因与耐药特性分析

对海南地区患病暹罗鳄(Crocodylus siamensis)体内分离出的10株气单胞菌(5株嗜水气单胞菌、3株达卡气单胞菌、1株简达气单胞菌和1株维氏气单胞菌)进行了毒力基因、耐药基因的检测以及抗生素药物敏感性试验.结果 表明:气溶素、肠毒素、蛋白酶等基因检出率较高,其中,lip和ela2种毒力基因检出率高达100...     

中华鳖爆发性传染病研究——Ⅳ.不同生化类型嗜水气单胞菌aer基因的PCR比较

用PCR技术对 5 2株不同来源和不同毒力的鳖源嗜水气单胞菌的aer基因进行了比较和分析。结果表明 ,b、d、e和 g四种生化型的嗜水气单胞菌含有特异的 2 0 9bp片段 ,而c和f两种生化型和其他鳖源致病菌却呈阴性反应 ,显示并非所有的嗜水气单孢菌都有aer基因 (产生气溶素 )。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段（去除信号肽）全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T细胞（Th）抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。     

红龙鱼源β-溶血性嗜水气单胞菌AH的分离及其对机体铁代谢的影响

对具有典型败血症病症的染病红龙鱼进行病原菌分离鉴定分析。从其肝脏中分离得到病原菌菌株AH,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定为嗜水气单胞菌。通过多重PCR检测确认该嗜水气单胞菌AH属于β-溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。此外研究嗜水气单胞菌AH侵染红龙鱼后对其机体铁代谢的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌AH,在侵染后不同时间点收集红龙鱼的血液和肝脏组织,分别采用分光光度计法和电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry,简称ICP-AES)法检测红龙鱼血清和肝脏中的铁含量,同时采用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导子和转录激活因子3基因(stat3)表达量进行检测。结果表明,侵染嗜水气单胞菌AH后,红龙鱼血清中铁浓度明显降低,在24、48h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组差异没有达到显著水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量在一定时间范围内显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但在各时间点的表达量均高于对照。由结果可知,机体通过调节铁调素基因(hepc)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁含量,并增加储存铁含量来应对细菌的侵染。     

羊源杀鲑气单胞菌16S rRNA基因的克隆测序及分析

从重庆市丰都县无菌采集山羊血液,提取全血基因组,用16SrRNA基因的引物进行PCR扩增,得到2条长约1 500bp的扩增片段,将其克隆到pMD19-T载体后进行测序,并与3条豚鼠气单胞菌,3条嗜水气单胞菌,3条中间气单胞菌,4条杀鲑气单胞菌,2条温和气单胞菌,3条维氏气单胞菌和5条舒氏气单胞菌16SrRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明:所克隆的基因片段长度均为1 507bp,GenBank登录号为JF823571和JF823572.系统发育分析发现2条序列均被聚类到杀鲑气单胞菌群,并与温和气单胞菌聚类到一个大的分支.同源性比对结果显示所获得的序列与杀鲑气单胞菌法国株(ATCC33658T)X74681和阿根廷株AF134065的同源性最高,均为99.6%,表明重庆地区存在受杀鲑气单胞菌感染的山羊.     

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。     

欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析

2000年夏季福建地区许多鳗场养殖的欧洲鳗暴发以脱粘、败血为主要症状的疫病，从不同来源的濒死鳗鱼体内分离到4株细菌。细菌的形态学、生化分析和补充试验结果符合嗜水气单胞菌的各项指标，PCR检测4株分离菌均扩增出特异性的气溶素基因（aerA)209bp片段及胆酶基因（Lip)760bp片段，进一步证实这些分离菌为嗜水气单胞菌并存在毒力基因。人工造病实验结果表明，分离株M00081205①的菌体纯培养物和胞外产物对昆明小白鼠和欧洲鳗分别具有中等和高度的致病力，初步证实嗜水气单胞菌是欧鳗夏季爆发性疫病的病原之一。     

溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离鉴定及其对鲥鱼机体免疫功能的影响

【目的】本文研究了湖北省武汉市一些养殖场鲥鱼发病原因以及致病菌对其免疫因子的影响。【方法】采用划线培养方法对染病鲥鱼进行了病原菌分离鉴定,从其肝脏中分离得到病原菌XF-6,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定,为嗜水气单胞菌。用多重PCR方法确认嗜水气单胞菌XF-6属于溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。同时研究了嗜水气单胞菌XF-6侵染对鲥鱼机体免疫功能的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌XF-6,在侵染后不同时间点采集鲥鱼的血液和肝脏,分别采用分光光度计法和ICP-AES法检测血清和肝脏铁浓度,运用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)的表达量进行检测。【结果】侵染嗜水气单胞菌XF-6后,鲥鱼血清中铁浓度明显降低,在12、24、48 h时显著低于对照组;血清中总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁浓度相对于对照组没有达到显著性差异水平,但仍有升高。肝脏中hepc基因的表达量在6、12、24 h时显著上升;肝脏中il-6基因的表达量在12、24、48 h时显著上升、肝脏中jak3基因的表达量在12、24 h时显著上升,肝脏中stat3基因的表达量在6、12、24 h时显著上升。这4种基因表达量随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。【结论】鲥鱼机体通过调节铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对病原菌的侵染。     

温和气单胞菌TL97528株丝氨酸蛋白酶基因片段克隆与序列分析

中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号分别为AF126213、AY841795、DQ127822、CP000462、CP000644、AF159142)同源性分别为98%、82%、82%、82%、81%、81%,与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为X67043)同源性为80%。用DNAstar软件分析,与鳖源温和气单胞菌TK961010株的同源性为98%,...     

温和气单胞菌TL97528株丝氨酸蛋白酶基因片段克隆与序列分析

中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号分别为AF126213、AY841795、DQ127822、CP000462、CP000644、AF159142)同源性分别为98%、82%、82%、82%、81%、81%,与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为X67043)同源性为80%。用DNAstar软件分析,与鳖源温和气单胞菌TK961010株的同源性为98%,...