水解乳蛋白及酪蛋白对破伤风梭菌产毒力的影响

水解乳蛋白及酪蛋白对破伤风梭菌产毒力的影响胡鸿刘玉明孟红宗晓龙李毅恒农业部兰州生物制品厂兰州７３００４６在破伤风毒素培养中，用１０％水解乳蛋白制造的产毒培养基（Ⅰ号产毒培养基）进行产毒培养，产毒能力较低，而用酪蛋白消化液制造的产毒培养基（Ⅱ号产毒培养...     

产气荚膜梭菌和腐败梭菌在厌氧菌基础培养基中的生长特性

测定了产气荚膜梭菌B型、D型和腐败梭菌在新研制的厌氧菌基础培养基中的生长曲线和产毒能力等特性。结果表明,这些细菌可以在新培养基中良好生长和产毒。产气荚膜梭菌B 型经2 h 的适应期后,很快进入对数生长期,培养到8 h细菌密度接近最高值,OD630为4.329;经检测,培养4 h~24 h的细菌所产生的毒素(培养物上清)1μL~2μL可致死KM小鼠。产气荚膜梭菌D型的生长速度也较快,无适应期就直接进入对数生长期,培养到12 h 时细菌密度最高, OD630 为1.75;细菌最佳产毒期在6 h~14 h,培养物上清0.5μL~0.65μL可致死KM小鼠。腐败梭菌生长速度较慢,经6 h的适应期后,才进入对数生长期,培养到14 h时细菌密度最高,OD630为1.335;细菌毒力在培养后的6 h~24 h内10μL菌液可达到在24 h内致死KM小鼠的效果。     

羊梭菌病多联灭活疫苗生产用厌氧培养基的研究

通过多次培养试验,研制成功了新的厌氧培养基.该培养基用于羊梭菌病多联灭活疫苗中的产气荚膜梭菌(B型、D型)和腐败梭菌的培养,细菌的产毒能力和免疫原性均达到了<中华人民共和国兽用生物制品规程>(简称<规程>)的要求,配制的疫苗成品检验全部合格.该培养基与<规程>提供的肉肝胃酶消化汤培养基相比,配制方法简单,节约人力和时间,所用试剂均可从市场购买,所需原料成本低廉,仅为肉肝胃酶消化汤培养基的21%～27%.     

二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌

用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示：气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-1株、C55-16株均扩增出大小为148 bp的条带,均与预期吻合;而产气荚膜梭菌C57-1株、C59-37株,肉毒梭菌C62-4株,诺维梭菌C61-4株均未扩增出任何条带。扩增产物的测序结果进一步证实了本方法的特异性。菌株的生物学特性试验结果也符合相应气肿疽梭菌和腐败梭菌的特点。本研究所建立的二重PCR方法可用于气肿疽梭菌和腐败梭菌的快速鉴定。     

高原牧区羊黑疫野毒分离株的生物学鉴定及免疫原性分析

为提高羊黑疫疫苗的免疫保护力,从青藏高原牧区病死羊体内分离的6株野毒株中筛选具有高免疫原性的B型诺维氏梭菌制苗用菌株,通过16S rRNA分子鉴定、α毒素基因片段的扩增、产毒素能力对比分析,筛选出1株产毒能力较高的TB05野毒株,以标准株为对照,研制了羊黑疫氢氧化铝菌苗,对其免疫原性进行了对比分析。结果显示,6株菌16S rRNA分子系统发育树亲缘关系较近,均扩增出大小为570 bp的α毒素基因片段;该TB05野毒株在含1.0%葡萄糖, pH值8.4～8.6的VF培养基中37℃72 h产毒最高,可达40 000 MLD/mL;疫苗对家兔的免疫保护力是对照组的2倍,血清抗体效价是对照组的3倍,免疫羊180 d后仍可抵抗2个致死量的攻击,免疫期远高于对照组的3个月。表明该野毒株具有较强的产毒稳定性和较好的免疫原性,可作为羊黑疫疫苗生产备用菌株。     

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示：制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F...     

B型诺维氏梭菌产毒素主要影响因子研究

为了掌握B型诺维氏梭菌同宝菌株(TB05)产毒特性,应用不同培养基、不同p H和不同培养时间进行最佳产毒比较试验。结果表明,该菌在含1.0%葡萄糖的VF培养基中37℃72h产毒达最高点,碳原比例及p H对本菌的生长及产毒具有较大的影响,1%葡萄糖、p H 8.0~8.4最适于本菌产毒。     

A型产气荚膜杆菌产毒条件的测定

以肉肝胃酶消化汤作为培养基,对同一A型产气荚膜杆菌分离株在33℃、35℃、37℃、39℃下培养,每个温度分别培养6h,7h,8h,10h,之后提取出每组的毒素,分别测定小白鼠的最小致死量,以确定最佳产毒条件,其中在35℃、7h产毒最强。按不同剂量进行接种,发现接种剂量对产气荚膜梭菌产毒也有较大的影响。     

夏季谨防鹅肉毒梭菌毒素中毒

肉毒梭菌是一种分布广泛、耐热、所产毒素毒力极强的大杆菌，存在于多数地区的土壤和污泥中，也存在于健康动物的肠内和粪便中。夏季，肉类、蔬菜、瓜果等有机物腐败，从而适合肉毒梭菌大量繁殖并产生大量毒素。鹅采食了这种腐败变质的饲料，很容易引起中毒。     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究Ⅲ.7株A型产气荚膜梭菌菌株的产毒素试验

本试验对7株A型产气荚膜梭菌菌株在不同培养基、不同培养温度和不同培养时间的产毒力进行了试验。结果表明，培养基的种类和培养时间对菌株的产毒素能力影响较大，而培养温度则影响较小。所试菌株中C57-1菌株的产毒素能力最强，是制备疫苗的最佳菌株。     

产气荚膜梭菌菌落多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α、β、ε、τ毒素基因序列,分别设计并合成针对4种毒素基因的特异引物,通过优化多重PCR反应条件,建立1种简单的产气荚膜梭菌定型菌落多重PCR方法。结果显示：A、B、C、D、E5型产气荚膜梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠杆菌、巴氏杆菌和芽孢杆菌则均未能扩增出相应条带;将单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段,该方法对B型和E型参考菌株最低检测量分别为2．6×10^4cfu／mL、1．2×10^4cfu／mL。应用该多重PCR方法从106份样品中检测到30株产气荚膜梭菌且均为A型,其中病死鸡的盲肠内容物分离率为36．5％（19／52）,健康鸡群新鲜粪便样品分离率为20．4％（11／54）。本研究建立的多重PCR方法特异性强,敏感度高,重复性好,可以有效进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种血清型的鉴别,对产气荚膜梭菌的感染及食品安全问题的研究均具有重要意义。     

绵羊猝狙的病原分离与鉴定

2000年7－8月，青海省同德县某乡藏系棉羊猝死，经对其中两只症状典型病死着羊病料分离培养，分离到数株疑似魏氏梭菌。通过肠内容物毒素检查、纯培养物毒素测定和毒素中和试验，证实致病力较强的两株为C型魏氏梭菌。毒价测定最小致死量均大于500小白鼠MLD。     

中国猪瘟兔化弱毒株（C-株）兔脾组织毒主要保护性抗原E2（gp55）基因序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株（C-株）兔脾组织毒主要保护性抗原E2（gp55）基因，成功地将其克隆并测定了核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒（HCV）E2基因序列比较的结果是C-株兔脾毒与C-株细胞（SK6）毒、C-株疫苗（犊牛睾丸细胞，HCLV-C）毒、HCV-SM株（石门）毒、Brescia株（荷兰）毒、Alfort株（德国）毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为C-株兔脾毒与C-株细胞毒的差异很小甚至没有差异，而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和90年代流行毒之间有明显的差异，表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。     

骆驼瘤胃内优势纤维素降解菌酶活种类及活力测定方法比较研究

利用传统纤维素酶活力测定方法———3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)和根据试验具体情况自行构建的纤维素酶活力测定方法,对健康骆驼瘤胃内自行分离的7株优势纤维素降解菌的纤维素酶酶活种类及活力进行了测定。测定结果为:DNS法中不同菌株的CX酶酶活大小为1#2#17#10#15#8#20#;C1酶酶活大小为1#2#17#20#10#15#8#;β-葡萄糖苷酶酶活大小为1#2#17#10#20#8#15#;总酶活大小为1#2#17#8#10#15#20#。自行构建方法中CX酶酶活大小为(1#、2#、15#)(10#、17#)(8#、20#);C1酶酶活大小为(1#、2#、15#、17#)(8#、10#)20#;β-葡萄糖苷酶酶活大小为(1#、2#、8#、10#、15#、17#)20#;总酶活大小为2#1#15#17#10#8#20#。根据测定结果可以看出,2种方法所测定的酶活大小趋势较为接近,但在试验过程中DNS法出现诸多问题,弊端较多,而自行构建的方法能够克服DNS法的缺点,使其结果更为简便直观,如果结合DNS法试验数据,则可以使试验结果更加精确。     

一复方藏兽药体外抗菌活性及药效学实验研究

采用平皿法和液体稀释法对急性支气管炎验方制剂进行体外抗菌试验。以急性支气管炎验方制剂药液灌胃给药测定其对小鼠的无毒剂量,同时测定甲型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌标准株对小鼠的最小致死量(MLD)。通过腹腔注射不同菌株(MLD 0.5mL)感染小鼠,以急性支气管炎验方制剂药液治疗。体外抗菌试验表明,急性支气管炎验方制剂对甲型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌标准株均有不同程度的抑制和杀灭作用。药效学实验表明,该验方制剂对人工感染小鼠有不同程度的保护作用,与对照组比较差异显著。说明该验方可以进行临床治疗试验。本实验为扩大应用范围及成果转化奠定了基础。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测动物肌肉组织中19种β-受体激动剂残留

建立了猪、牛和羊肌肉组织中吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗等19种β-受体激动剂残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法.猪、牛和羊肌肉组织样品用乙腈和异丙醇（8：2,V/V）提取,加入NaC1、Na2SO4和MgSO4盐析去杂质.待测药物经BEH C18色谱柱分离,以0.1％甲酸乙腈溶液和0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱.同位素内标法和基质匹配标准溶液外标法定量.19种β-受体激动剂在系列浓度范围内呈现良好线性关系,相关系数r2均大于0.99;19种药物在肌肉组织中的检测限为0.25 μg/kg,定量限为0.5μg/kg.从0.5、1和5μg/kg三个添加浓度检测结果可以看出,19种药物的回收率为73.7％ ～ 114.1％,批内批间相对标准偏差均小于20％.结果表明,该方法简便快捷、灵敏度高、定性准确,适用于该类药物残留的检测.     

产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌（B.Subtilis Natto）的筛选及其生物特性研究

采用酪蛋白平板和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板初筛法,分别从北京、大连、日本3个产地的纳豆食品中分离筛选到10株产蛋白酶菌株（NY-1～NY-10）和10株产纤维素酶菌株（NS-1～NS-10）。经酶活力测定NY-1为蛋白酶活力最高菌株,NS-1为纤维素酶活力最高菌株。通过2株菌的生长曲线、芽孢形成曲线、产酶动态变化曲线和酶活力传代稳定性试验,得出NY-1的最佳种龄为16 h,最佳芽孢收获时间为28 h,芽孢量的对数值为(6.92±0.047)、蛋白酶产酶高峰时间为18 h,酶活力为（44.12±1.48） U/mL,;NS-1的最佳种龄为14 h,最佳芽孢收获时间为28 h,芽孢量的对数值为(8.41±0.0060),纤维素酶产酶高峰时间为40 h,酶活力为（60.94±1.22） U/mL,蛋白酶和纤维素酶酶活力在7代内保持稳定。     

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用

据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。     

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 利用单因素及正交试验法对高产虾青素酵母菌株摇瓶发酵条件进行探索。结果表明,碳源以葡萄糖为宜,氮源以硫酸铵为宜,葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、酵母膏和番茄汁最适添加量分别为4%、0.4%、0.4%、0.6%和0.6%,培养基最适初始pH值为5,最适培养温度为22 ℃,最适装液量以50 mL/500 mL(发酵液体积/三角瓶体积)。     

L-乳酸、D-乳酸对3种食源性致病菌的抑制作用

选用金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli ATCC 43889)、福氏志贺菌(Shigella flexneri CMCC 51334)3株常见的食源性致病菌,用于测定L-乳酸、D-乳酸的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),并比较L-乳酸、D-乳酸对3株食源性致病菌抑菌效果差异.结果表明:L-乳酸、D-乳酸对3株食源性致病菌均有不同程度的抑制作用,金黄色葡萄球菌MIC0.1 mg/mL、MBC 3.2 mg/mL,大肠杆菌MIC 0.1 mg/mL、MBC 1.6 mg/mL,福氏志贺菌MIC 0.1 mg/mL、MBC3.2mg/mL.在所选3株指示菌浓度105～106 CFU/mL、乳酸0.2 mg/mL质量浓度下,L-乳酸的抑菌效果显著高于D-乳酸.