猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立与应用

以猪圆环病毒2型为材料,设计了3对引物,构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2型的LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果,为猪圆环病毒2型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

摘要：猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属,是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMws）的主要病原。该病在世界范围内广泛流行,给我国养猪业造成一定的经济损失。目前针对PCV-2的检测技术还有提升的空间,因此本研究针对PCV-2Cap基因高度保守的区域作为靶序列设计引物,建立了一种可快速、灵敏、特异地检测PCV-2的LAMP检测方法。     

猪圆环2型病毒环介导等温扩增实时检测方法的建立与评价

以猪圆环2型病毒为材料,设计了2对引物,构建了猪圆环2型病毒实时环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环2型病毒实时LAMP检测方法,通过应用实时浊度仪可以对猪圆环2型病毒进行快速检测。     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测猪细小病毒的试验

利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP),建立了一种灵敏、特异、快速的猪细小病毒(PPV)检测方法.该方法针对猪细小病毒非结构蛋白(NS-1)基因保守区域设计6条特异引物,在63℃的等温条件下45 min即可完成反应.最低检测限量为10拷贝的PPV目的基因,比常规聚合酶链式反应(PCR)方法敏感100倍,并具有良好的特异性.以钙黄绿素和Mn2+作为荧光指示剂,可快速、直观判定反应结果.通过对149份临床样品进行检测比较,LAMP与PCR检出阳性样本数分别为33份和27份,表明LAMP方法阳性检出率高于PCR.     

环介导等温扩增法(LAMP)在水生动物病害检测中的应用

近年来我国的水产养殖发展迅速,养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖的一个问题,而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入,病原的检测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增(l oop-medi at ed i sot hermalampl i f i cat i on,LAMP),综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展,并对该方法的应用前景做了展望。     

基于荧光显色的环介导等温扩增技术(LAMP)检测禽呼肠孤病毒

建立了一种基于荧光显色的禽呼肠孤病毒(ARV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法.该检测方法使用针对ARV的p10基因8个区域的6条LAMP引物,能够在等温(63℃)条件下1h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低能够检出102个拷贝的病毒,敏感性比普通PCR高100倍,而对其他病毒检测结果为阴性.在荧光显色中分别应用SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素作为显色剂,其结果与琼脂糖凝胶电泳一致.在对80份临床样本的检测中,使用LAMP和PCR检测出阳性样本的数量分别为68份和55份.因此,基于荧光显色的LAMP方法可以应用于ARV的快速检测,具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力.     

新城疫病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)La Sota毒株保守蛋白F蛋白的编码序列,设计2对环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对甜菜碱浓度、Mg2+浓度、反应温度等LAMP反应体系的最佳反应条件,以及特异性、敏感性等进行研究,建立了一种特异性检测NDV的LAMP方法。结果显示,该方法最低能检测到10个拷贝数的病毒核酸,与其他禽类病毒无交叉反应,且向反应产物中加入SYBR GreenⅠ可直接观察样品是否含有NDV,表明建立的LAMP检测方法具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的易操作性,且成本较低,为出入境检验检疫系统进一步搭建NDV快速高通量检测平台奠定基础。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立与评价

根据猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep和Cap基因保守区设计2对引物,1对外引物和1对内引物;利用设计的4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对PCV2 DNA进行恒温扩增;扩增条件为63℃恒温反应1h;建立了PCV2环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对检测方法特异性评价表明,检测方法只能检测PCV2 DNA,对猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)及猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)检测无交叉反应。灵敏度评价表明,该检测方法可以检测到样品中10个拷贝的PCV2 DNA含量。     

Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Mycobacterium bovis

Bovine tuberculosis caused by Mycobacterium bovis is an important zoonosis. In this study, a simple, rapid method for detecting this organism was developed based on loop-mediated isothermal amplification of the mpt83 gene. The technique will be of value in the clinical and field-based diagnosis of M. bovis and can differentiate it from other bacteria such as Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pneumoniae, β-haemolytic streptococci, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus, and Klebsiella pneumoniae. The limit of detection was 10 copies/μL and the results were corroborated by PCR. The method was highly specific and more sensitive than PCR.     

检测蜜蜂囊状幼虫病毒环介导等温扩增技术的建立

为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列(AF092924.1)设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

绵羊肺炎支原体LAMP检测方法的建立及初步应用

针对绵羊肺炎支原体(Mo) 16S rRNA基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件与体系,建立了Mo检测LAMP方法,并对其进行特异性、敏感性及临床应用性检测.结果显示,于60℃保温60 min即可最优化检测Mo,且所建方法仅能特异扩增Mo,最低检出分子拷贝数为1.0×102copies/μL,具有良好的特异性和敏感性.对4份已知阳性病料进行LAMP检测均为阳性,表明所建LAMP可初步应用于临床检测,为羊Mo感染病例诊断提供了新方法.     

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法。针对Hps16S rRNA基因保守区域设计6条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对模板DNA进行梯状等温扩增,并且优化LAMP的反应体系,检验其灵敏性与特异性。结果表明:该方法对Hps的最小检测限为0.2pg/μL,灵敏性高于常规PCR方法103倍;完成反应仅需65min。该方法灵敏度高、特异性好,能够作为Hps的快速诊断方法,对于基层和实验室应用均具有良好前景。