应用间接免疫荧光法检测禽网状内皮组织增生病病毒抗体的研究

用禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）感染ＳＰＦ鸡胚次代成纤维细胞涂片为抗原，建立了检测ＲＥＶ抗体的间接免疫荧光法（ＩＦＡ）。确定了待检血清稀释度１：６４和兔抗鸡ＩｇＧ荧光抗体的稀释度１：３２的工作浓度。应用该ＩＦＡ方法对人工感染ＲＥＶ的２０只３０日龄ＳＰＦ鸡进行了检测，接种后４天时均呈阴性反应，７天时８只鸡呈阳性反应，１４天２０只全部呈阳性的反应。通过对ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＡＬＶ、ＭＤＶ、ＣＩＡＶ、     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７℃孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗、进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２Ｏ、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＥＤＳＶ均为阴性。结果表明、用此法检测鸡胚尿囊液中ＩＢＶ．具有快速、敏感、特异的优点。     

牛轮状病毒重组株的血清学和基因型特性

从母牛接种过Ａ组ＢＲＶ株ＮＣＤＶ－Ｌｉｎｃｏｌｎ（Ｐ１：Ｇ６）苗的两个吡邻牛场分离到两株牛轮状病毒（ＢＲＶ），编号为ＮＳ－１和ＮＳ－２，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验表明，ＮＳ－１和ＮＳ－２有相的的Ａ组ＲＮＡ电泳模式，而且全部基因片段同源，体外中和试验表明，ＮＳ－１株病毒能被Ｇ６特异性单克隆抗体（ＭｃＡｓ）和抗ＢＲＶＢ６４１株（Ｐ５：Ｇ６）豚鼠高免血清（ＧＰＡＳ）中和，但不被Ｇ１０特异性Ｍ     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因免疫对鸡的保护作用

将鸡传染性支气管炎病毒肾型 Ｔ 株 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 连接于ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 的 Ｈｉｎｄ Ｉ Ｉ Ｉ与 Ｂａ ｍ Ｈ Ｉ位点之间构建含有 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子及 Ｂ Ｇ Ｈｐｏｌｙ Ａ 信号序列的鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 蛋白真核表达质粒。实验证明, Ｓ Ｐ Ｆ 鸡肌注免疫后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体逐渐升高,至第３５ 日龄左右达到高峰,攻毒后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体先下降而后升高,血清 Ｉｇ Ｇ 抗体升高幅度不及 Ｉ Ｂ 油苗免疫组。质粒 Ｄ Ｎ Ａ 免疫鸡攻毒后有４０ ％ 的鸡可耐过强毒的攻击,说明 Ｓ１ 基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达

将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。     

原位杂交检测鸡传染性支气管炎病毒

本文以鸡传染性支气管病毒 Ｈｏｌｔｅ 株 Ｓ１ 基因为基本材料制备 Ｄｉｇ 标记的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,首次以原位杂交技术检测了肾病型传染性支气管炎病毒感染鸡体内的 Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 分布情况。结果表明,病毒感染后第３～７ 天, Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 主要分布于肾脏,且主要位于肾小管上皮细胞核内, Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 在其它器官中分布甚少。 Ｉ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 的分布数量与所在器官的组织病变有一定关系。     

传染性法氏囊病强毒感染与鸡法氏囊植物凝集素受体的关系

用４种辣根过氧化物酶标记植物凝集素（ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＳＢＡ、ＲＣＡ）作探针，观察了接种传染性法氏囊病强毒（ＩＢＤＶ）和不接种毒组鸡肠、气管和法氏囊凝集素受体的变化．结果发现，接毒组法氏囊粘膜上皮存在ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ受体．滤泡细胞含有ＣＯＮＡ、ＷＧＡ．ＲＣＡ、ＳＢＡ受体；未接种毒组粘膜上皮存ＣＯＮＡ、ＳＢＡ受体，滤泡细胞仅有ＷＧＡ受体．接毒组或非接毒组肠和气管粘膜上皮均含有ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ受体．这些部分存在凝集素受体可能与ＩＢＤＶ感染有关．     

鸽新城疫病毒的分离及其生物学特性测定

用ＳＰＦ鸡胚从疑似鸽新城疫（鸽ＮＤ）病鸽群中分离到一株病毒ＱＬ株,该病毒株能凝集鸡红细胞（ＲＢＣ）,这种凝集作用能被抗新城疫病毒（ＮＤＶ）阳性血清抑制;用抗ＮＤＶ单抗ＰＥＧ夹心ＥＬＩＳＡ测定分离株为阳性。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡,出现与自然发病鸽一致的症状和病变,但肌注ＳＰＦ鸡只感染,不见临床症状。对该分离株作进一步生物学特性鉴定,按照国际上规定的ＮＤＶ毒力判定标准,测定了该毒株最低致死量致死鸡胚的平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄雏鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）,结果ＭＤＴ为１０５小时、ＩＣＰＩ为１．３３、ＩＶＰＩ为１．０。试验结果表明本分离株为鸽新城疫病毒。     

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物,位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ,扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后,分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理,结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）, Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）, Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）;５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异,这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

应用间接免疫荧光法检测禽网状内皮组织增生病病毒抗体的研究

用禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）感染ＳＰＦ鸡胚次代成纤维细胞涂片为抗原,建立了检测ＲＥＶ抗体的间接免疫荧光法（ＩＦＡ）。确定了待检血清稀释度１∶６４和兔抗鸡ＩｇＧ荧光抗体的稀释度１∶３２的工作浓度。应用该ＩＦＡ方法对人工感染ＲＥＶ的２０只３０日龄ＳＰＦ鸡进行了检测,接种后４天时均呈阴性反应,７天时８只鸡呈阳性反应,１４天２０只全部呈阳性的反应。通过对ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＡＬＶ、ＭＤＶ、ＣＩＡＶ、ＡＩＶ等标准阳性血清的交叉试验,证明该方法特异性强。应用该ＩＦＡ方法对我国辽宁、山东、黑龙江省部分鸡群进行ＲＥＶ抗体检测,证明该方法特异性强、敏感性高,适于在生产中推广应用。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，减蛋综合症病毒等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７Ｃ孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗，进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＴＢＤＶ、ＩＬＴ     

应用间接免疫荧光法检测鸡传染性贫血病病毒抗体的研究

用鸡传染性贫血病病毒（ＣＩＡＶ）ＭＳＢＩ－ＴＫ５８０３毒株感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ；细胞涂片为抗原，建立了检测ＣＩＡＶ抗体的间接免疫荧光法（ＩＩＦＡ）。应用该ＩＩＦＡ方法对人工感染的ＳＰＦ鸡进行了检测１５只１日龄ＳＰＦ鸡在接种后第７、１４天时均呈阴性反应；２１天时２只鸡呈弱阳性反应，２８天时均呈弱阳性反应，２１天时２只鸡呈弱阳性反应，２８天时均呈弱阳性反应，３５天时呈明显阳性反应；１４只４０日龄ＳＰ     

传染性法氏囊病强毒感染与鸡法氏囊植物凝集素受体的关系

用４种辣根过氧化物酶标记植物凝集素（ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＳＢＡ、ＲＣＡ）作探针，观察了接种传染性法氏囊病强毒（ＩＢＤＶ）和不接种毒组鸡肠、气管和法氏囊凝集素受体的变化，结果发现，接毒组法氏囊粘膜上皮存在ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ受体。滤泡细胞含有ＣＯＮＡ、ＷＧＡ、ＲＣＡ、ＳＢＡ受体；未接种毒组粘膜上皮存在ＣＯＮＡ、ＳＢＡ受体，滤泡细胞仅有ＷＧＡ受体。接毒组或非接毒组肠的气管粘粘膜上皮均含有ＣＯＮＡ、Ｗ     

禽流感RT—PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法,应用此法对鸡胚培养ＡＩＶ尿囊液,ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）,传染性氏囊病病毒（ＩＢＤ     

DNA免疫防制鸡传染性支气管炎的探索研究

ＯＲＦ完整的ＩＢＶ类Ｍ４１株Ｓ１基因ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＣＩ ＣＭＶ启动子下游我隆位点，构成ｐＣＩＳ１用于１周龄ＳＰＦ雏鸡的ＤＮＡ免疫试验。试验鸡生疏腿部肌肉注射ｐＣＩＳ１ＤＮＡ１００ｇ，２周后加强免疫一次。二次免疫２周后，代感染ＩＢＶ Ｈ５２株。结果，ＩＢＶ人工感染后第４天气管－泄殖腔棉拭子鸡胚病毒分离阳性者，免疫试验组为１／６，而对照组为６／６，鸡胚病毒中和试验显示，二次免疫后临感染前及     

禽用生物制品外源病原监测研究：鸡新城疫LaSota活苗中污染IBV的检测研究

使用ＳＰＦ鸡制备的抗ＮＤＶ（新城疫病毒）高免血清可中和ＮＤＶ种毒或鸡新城疫疫苗ＬａＳｏｔａ株１０~７ＥＩＤ５０／０．１ｍｌ（即１０个使用剂量），并具有高度持异性。对于ＮＤＶ疫苗实验室模拟污染ＩＢＶ传染性支气管炎病毒）研究表明，用ＮＤＶ高免血清中和ＮＤＶ疫苗１０个使用剂量后，可检测到ＩＢＶ１０~（－６）污染水平。对于某生药厂ＮＤＶＬａＳｏｔａ疫苗中疑似ＩＢＶ污染的样品进行检测，排除了ＩＢＶ污染。文章同时证明了免疫胚接种ＮＤＶＬａＳｏｔａ毒后胎儿表现出类似感染了ＩＢＶ的病变。     

不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

抗牛IgGFc受体单克隆抗体的生产与鉴定

利用阳性表达细胞和荧光激发流式细胞分类器建立了一个单克隆抗体的制备与快速鉴定系统。用克隆于表达性质粒载体ｐＣＤＭ８的牛ＩｇＧ＿１Ｆｃ受体（ｂｏＦｃγＲⅡ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ７细胞并用被转染细胞作抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＮＳＯ浆细胞瘤细胞株融合，筛选克隆出３株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤，即ＣＣ－Ｇ３６、ＣＣ－Ｇ３７和ＣＣ－Ｇ３９。经使用荧光激发流式细胞分类器检测，３个单克隆抗体均识别经ｂｏＦｃγＲⅡ转染的ＣＯＳ７细胞而不识别未经转染的ＣＯＳ７细胞和经牛ＩｇＧ＿２Ｆｃ受体（ｂｏＦｃγ２Ｒ）转染的ＣＯＳ７细胞。３个单克隆抗体分别为ＩｇＧ＿１（ＣＣ－Ｇ３６）、ＩｇＧ＿２ａ（ＣＣ－Ｇ３７）和ＩｇＧ＿３（ＣＣ－Ｇ３９）。本研究还用同样方法验证了单克隆抗体ＣＣ－Ｇ２４抗ｂｏＦｃγ２Ｒ的特异性。