河南商品蛋鸡群中鸡马立克氏病的流行病学研究

2011-2012年,河南省大面积暴发商品蛋鸡群肿瘤病,临床剖检疑似马立克氏病(Marek’s disease,MD),为进一步确诊病因,根据马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)的meq、gB和pp38基因分别设计了3对特异性引物,利用PCR技术对送检的疑似病例鸡的肝脏和脾脏样品分别进行了检测和分析。结果显示,各地区随机抽取的5只病例鸡肝脏、脾脏样品中均扩增出3种不同大小的MDV特异性病毒基因PCR产物,这表明MDV在河南鸡群中广泛流行,并导致了商品蛋鸡群MD的暴发。研究结果填补了河南省MD流行病学空白,为今后MD的临床快速诊断及有效防控提供了重要参考依据。     

鸡马立克氏病的综合防制

鸡马立克氏病(MD)是由疱疹病毒引起的一种高度接触传染性淋巴组织增生性肿瘤病.此病的特征是外周神经淋巴样细胞浸润和增大,以及性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤产生肿瘤病灶,发病率和死亡率基本相等.近年来,新疆境内MD的发生呈不断上升趋势,发病率,死亡率都较高,已成为危害我区养鸡业的主要传染病之一.据笔者调查,个别养鸡场的发病率竟高达60%～80%,给养鸡户带来巨大的损失,对此必须引起高度重视.MD发病无季节性,一年四季均可发病,我区南北疆都有MD发生的报告.目前,各地已把预防免疫作为控制 MD的主要措施,但由于种种原因,MD一直未得到有效控制.因此,要控制MD的发生,必须采取以下三个方面的综合防制措施.     

一例鸡马立克氏病的诊治报告

<正>鸡马立克氏病是由鸡马立克氏病毒引起的一种高度接触性肿瘤疾病,该病以外周神经、内脏器官、性腺、肌肉和皮肤单独或多发的淋巴样细胞浸润为特征。日龄越小感染性越高,多在2~5月龄发病,发病率和死亡率差异较大,发病率为5%~80%,死亡率为50%~80%。本病一旦感染,感染鸡终生带毒、排毒。传     

鸡马立克氏病二价疫苗免疫鸡的病理组织学研究

1日龄雏鸡接种鸡马立克氏病二价疫苗(SB-1+HVT)3000PFU,而后18日龄攻以MDBJ-1血毒.定期剖杀三例并观察大体或显微MD组织病变.直至98日龄,在鸡内脏和外周神经等组织中始终可见到网状细胞或淋巴细胞的轻度增生.二价疫苗与HVT冻干苗、SB-1单价苗在相同条件下进行了比较.试验结果表明,眼观病变及组织淋巴细胞增生的出现,病灶范围和病变程度,经二价疫苗免疫的鸡较其他免疫鸡表现轻微.通常二价疫苗仅仅产生长期的轻度非致瘤性组织病理变化.     

马立克氏病肿瘤细胞表面抗原的提取与鉴定

用MDVGA株感染1日龄SPF雏鸡,饲养至发病后获得MD肿瘤细胞,采用木瓜蛋白酶消化法从MD肿瘤细胞上提取马立克氏病肿瘤相关的表面抗原,经间接荧光抗体染色和间接ELISA鉴定,证明获得的粗提物中含有马立克氏病肿瘤相关的表面抗原,为进行马立克氏病肿瘤相关的表面抗原的进一步研究奠定了基础。     

H5亚型禽流感病毒HA基因在WISH细胞中的瞬时表达

在WISH细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染WISH细胞。通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在WISH细胞中进行了表达。     

河南鸡群马立克氏病病毒流行毒株的分子进化分析

为了解鸡马立克氏病病毒流行毒株的分子特征,对2012-2014年河南省发病鸡群的临床病料进行了采集,并对MDV 132 bp重复序列进行了PCR扩增,同时对meq、g E、g I基因进行了克隆和序列测定。结果表明,9份病料中均可扩增出与132 bp双拷贝大小相符的PCR主产物;meq、g E、g I基因的核苷酸序列同源性与国内外参考毒株相比,分别为98.5%~100%,98.8%~100%和98.0%~100%;基于这些基因构建的系统发生树的分析结果表明,与美国、澳大利亚、日本以及印度的MDV分离株相比,目前,河南省鸡群中流行的MDV与此前分离的河南流行株进化关系较近,并且与其他国内分离株共同形成一个较大的独立进化分支。     

鸡马立克氏病液氮苗的正确使用方法

鸡马立克氏病液氮苗使用是否正确，直接决定疫苗的使用效果。为此，本文将其正确使用方法介绍如下，以期为基层养殖人员或动物防疫人员提供参考。     

鸡眼型大肠杆菌与马立克氏病混合感染的诊治

2006年元月份,石河子市郊某养鸡专业户饲养的麻花鸡约有2000余只,于3月龄时发现每天死亡十余只,连续出现流泪、排白色稀便等为主要特征的疾病。经临床观察、病理剖检和实验室诊断。确诊为眼型大肠杆菌与马立克氏病混合感染。     

猪流感H3N2亚型HA 基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究

采用PCR方法扩增出猪流感病毒四川分离株H3N2亚型HA全基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,成功构建出真核重组质粒pcDNA3.1-HA.采用纯化后的pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒以不同的组合免疫4～6周龄的Balb/c小鼠,免疫2次间隔3周,加强免疫3周后,小鼠接种致死量的H3N2病毒;检测免疫后小鼠的血清抗体水平及攻毒后肺部病毒残留.结果表明,pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒免疫小鼠后,均能够产生一定的免疫效果,能为小鼠提供H3N2亚型猪流感病毒保护.     

H5N1型禽流感病毒HA基因克隆及序列分析

为从分子生物学角度进一步研究H5N1型禽流感主要抗原HA基因,探究H5N1 HA基因的遗传变异情况及其蛋白结构,根据GenBank中登录的H5N1型禽流感HA基因的序列利用Primer 5.0设计引物扩增HA基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-H5N1-HA进行测序分析。应用生物信息学软件对禽流感病毒HA基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、保守区分析,磷酸化位点和序列重复区分析及HA蛋白二级、三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：HA基因长1661 bp,共编码326个氨基酸;生物信息学分析结果表明：HA基因在种间具有较高保守性,HA基因的氨基酸序列与其他地方性禽流感H5N1病毒株HA基因的序列同源性最高可达99.7%,且为高致病性毒株;HA蛋白的二级、三级结构预测结果显示：HA蛋白多为α螺旋和β转角结构,无规则卷曲,是亲水性蛋白。该结果为禽流感病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础.     

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。     

禽流感诊断技术研究进展

摘要：禽流感是由A型流感病毒引起的一种人兽共患病,不仅给养禽业带来重大经济损失,并且已经严重威胁到人类健康。由于流感病毒具有亚型多、抗原变异性较强、宿主范围广等特点。因此,建立一种快速、有效的流感病毒检测方法就显得非常重要。笔者就目前流感病毒的检测技术,包括诊断做一综述,以期为有效控制禽流感的发生与流行提供强有力的技术支撑关键词：禽流感病毒;检测技术;研究进展     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的构建和活体电击免疫试验初报

将高致病力禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的HA基因克隆到质粒pcDNA4/His鄄Max和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5。将pC4H5和pCMVH5经活体电击和肌肉注射接种于3周龄SPF鸡的右腿内侧,并设空白质粒对照。二次免疫后第二周用104.2ELD50的同源病毒进行攻击。结果pC4H5和pCMVH5活体电击免疫SPF鸡能诱导产生持续表达的高水平特异性抗体,可产生100%的保护率,并能有效地阻止H5N1病毒攻击后病毒在泄殖腔的排出,而肌肉注射组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明活体电击免疫是一条可以与基因枪免疫相媲美甚至优于基因枪免疫的有效免疫途径。     

表达鸡白细胞介素18重组禽痘病毒的构建及其表达产物生物学活性的检测

为构建表达鸡IL-18的重组禽痘病毒，将含痘病毒启动子IP2EP2驱动的鸡，IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681／ChIL-18。将pSY681／ChIL-18转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IL-18的重组禽痘病毒rFPV-ChIL-18。在含有X—gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后，对重组病毒rFPV-ChIL-18又进行了多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板，利用鸡IL-18基因特异引物进行PCR，扩增出1条约0．6kb的带。收集含鸡IL-18蛋白的细胞上清液进行MTT试验，表达的产物能明显提高鸡淋巴细胞的转化率。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒H9亚型HN31株NS基因

为克隆和分析禽流感病毒（H9亚型）HN31株的NS基因的分子特征,通过RT-PCR方法扩增其NS基因,PCR产物与载体pMD19-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选,调取阳性菌落,摇菌过夜,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定,送阳性重组质粒测序。结果显示RT-PCR产物大小为919 bp,HN31株的NS基因长度为890 bp;其与H6、H9亚型的A型流感病毒的亲缘关系比H5、H7、H3、H1亚型流感病毒更近。