影响农杆菌介导甜瓜子叶遗传转化的因素

以甜瓜子叶作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过GUS基因瞬时表达率的分析,研究此转化体系的最佳实验参数.实验结果表明,预培养时间、预培养后对外植体进行处理、感染时间、共培养时间、农杆菌工程菌的浓度等对转化效率都有一定的影响,但是根癌农杆菌诱导物AS并不能大幅度提高转化效果.对外植体进行重新处理,预培养2 d,用OD560为0.3的农杆菌工程菌感染15～25 min,共培养3～4 d的理想条件下,GUS瞬时表达率可达85%.     

农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用

农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法,该方法通过在植物叶片上注射农杆菌,使目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用,其应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位以及基因相互作用等方面。随着技术的进一步完善,我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。     

根癌农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展

对根癌农杆菌介导的玉米基因转化中包括外植体、基本培养基及其附加物、共培养温度、信号分子与vir基因的活化的几个关键因素研究进展作了论述。近年来的研究发现，大小为1~2mm的幼胚是较为理想的转化外植体，在外植体培养基本培养基一般多选用MS和N6，在基本培养基上附加有机氮和氨基酸、金属离子均有利于转化效率的提高。转化中的共培养温度一般在200C~250C之间。研究认为根癌农杆菌转化禾本科植物的困难在于禾本科植物缺乏酚类物质，难以诱导Vir基因活化表达，因此在转化中多采用加入外源的酚类物质如乙酰丁香酮来提高玉米转化的成功率。     

影响农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化番茄主要因子的研究

LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一,位于合成代谢的重要分支点上,直接影响β-胡萝卜素的合成.以番茄子叶、茎段作为转化受体,通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物番茄,对影响转化的几个因素进行了研究.结果表明,转化受体经预培养比未预培养有利于农杆菌的侵染转化;侵染时间子叶以10min、茎段以15min为宜;农杆菌菌液浓度OD600以0.7为佳;添加AS可提高抗性愈伤的诱导率,S的添加以100μmol/L效果较好;延迟筛选有利于提高抗性愈伤诱导率.     

根癌农杆菌介导伪狂犬病毒gD基因转化玉米的研究

将克隆的猪伪狂犬病毒保护性抗原基因gD插入质粒pBA002,构建了植物表达载体pBA-gD.利用根癌农杆菌LBA4404介导,将该基因导入甜玉米自交系1132,转化获得84株转基因系.经过点杂交、Southern杂交分析,有23个转基因株系基因组检测到gD基因稳定整合.Northern杂交显示有5个转基因株系的目标基因正确表达.     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southern blotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20％以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10．5％和0．383％,与对照相比分别提高了32．74％和35．34％,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。     

转根癌农杆菌介导的AtNHX1基因马铃薯的获得

构建重组表达质粒pBI12135-GZ+AtNHX1（带有CaMV 35S启动子）,通过农杆菌将其携带的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX）转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”试管薯薄片和“克新2号”茎段。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50 mg L^-1卡那霉素 +300 mg L^-1头孢霉素筛选抗性芽,试管薯薄片获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37%;茎段未获得抗性植株。抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90%。Southern杂交结果证实,外源基因多以双拷贝整合到马铃薯的基因组中。Northern杂交结果表明,转基因植株可以进行AtNHX1基因mRNA的正常转录,但植株间存在着转录量的差异。该研究为耐盐马铃薯的培育奠定了良好的基础。     

根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA+CpTI)苎麻

利用苎麻下胚轴高频再生体系,将携带人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因的植物表达载体pGBI4ABC转化到苎麻主栽品种中苎1号中。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50 mg L^–1卡那霉素+ 300 mg L^–1头孢霉素筛选共获得32株抗性植株; PCR检测显示26株为阳性, 占80%。Southern杂交结果证实, 外源基因已经整合到苎麻的基因组中。这项研究为最终创造兼抗鳞翅目及鞘翅目等害虫的苎麻种质材料奠定了基础。     

农杆菌介导外源基因在棉花中的表达

用 5～ 6d的棉花无菌苗下胚轴切段与农杆菌共培养 ,菌株质粒中 Gus基因为标记基因 ,NPT 基因为选择基因。在含 0 .1 mg· L- 12 ,4- D和 0 .1 mg· L- 1KT的 MS培养基上共培 48h,转移到添加头孢霉素 50 0 mg· L- 1、卡那霉素 50 mg· L- 1MS培养基中诱导和筛选抗性愈伤组织 ,70～ 80 d时 ,进行 Gus检测 ,选择 Gus阳性愈伤组织 ,经体细胞分化生成转基因再生植株     

根癌农杆菌介导籼稻遗传转化影响因素研究

研究了抗生素种类、继代和菌液浓度对农杆菌介导籼稻转化的影响，并将反义蜡质基因导入4个高产、直链淀粉含量高的籼稻品种中。结果显示，羧苄青霉素的抑菌效果优于头胞霉素，其适宜浓度为250～350mg/L；4个品种继代愈伤比初代愈伤能获得更高的抗性愈伤得率；各个品种转化有其最佳的农杆菌菌液浓度（OD600值），茉莉新占和绿黄占为1．0，粤香占和矮秀占为0．6。应用此优化的农杆菌转化体系，我们得到了转化植株；PCR扩增和Southem杂交结果证明外源基因已经整合到转基因水稻的基因组中。     

不同农杆菌菌株和棉花品种在转基因棉花中的应用研究

本试验采用农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株ＡＧＬ—１—１１、４４０４—７、２０８—１、２８１—６，与陆地棉品种晋棉７号、柯字２０１、相字３１２、冀合３２１的下胚轴切段共同培养，将Ｂｔ内毒素基因导入棉花愈伤组织，经体细胞胚胎发生途径转化再生植株。试验结果表明：菌株间转化率差异较大，菌株ＡＧＬ—１—１１、４４０４—７表现较好。品种之间在转化率上互有高低，差异不显著     

喀斯特温和气候区半夏不同遮荫研究

研究不同遮荫条件下半夏的生长及增产效果。设SZW-8型、SZW-12型遮阳网遮荫及不遮荫3个处理,采用塑料钵进行试验,考察半夏鲜品产量、粒数、粒重和植株性状。SZW-8型、SZW-12型遮荫的半夏产量分别比不遮荫的降低0.73倍和1.82倍,其块茎粒数、粒重均低于不遮荫处理;随着遮荫率的增加,半夏株高、茎高增加,但叶长、叶宽与遮荫无关。在喀斯特温和气候区,半夏栽培以不遮荫为好。     

旱半夏ISSR-PCR反应体系的优化

为了建立和完善旱半夏的ISSR-PCR反应体系,本研究以四川地区野生旱半夏为试验材料。以旱半夏整株的基因组DNA为模板,初筛的UBC818号引物用于ISSR-PCR体系,采用正交实验L₁₆(4⁵)并结合单因素实验方法对体系进行优化。通过正交试验结果直观评分可知各因素对该实验结果的影响强度从高到低依次为:d NTPs,引物,Mg²⁺,Taq DNA聚合酶,DNA模板;单因素实验结果表明,最优的20μL反应体系为:d NTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,Mg²⁺2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/μL,DNA模板15 ng,退火温度为56℃。本研究通过优化ISSR-PCR反应体系,此体系将应用于半夏组培苗遗传稳定性的检测。     

半夏人工种子制作技术及其萌发研究

以半夏为实验材料,通过固体培养转液体悬浮培养建立小块茎悬浮系,并以小块茎为人工种子的繁殖体,研究了人工种皮基质、人工胚乳组分、贮藏条件、萌发基质等对人工种子萌发率和成苗率的影响.结果表明,以4.0%海藻酸钠+2.0% CaCl_2+2.0%壳聚糖为人工种皮基质,1/2 MS液体培养基+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L GA_3+0.5 mg/L BA+0.4mg/L青霉素+0.3%多菌灵粉剂+0.2%苯甲酸钠+1.0%蔗糖+0.5%活性炭作为人工胚乳成分制作的人工种子,其萌发率和成苗率最高.这样的人工种子在4℃条件下贮藏20 d后的萌发率及成苗率分别达82.8%和78.6%,随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长,人工种子的萌发率和成苗率均大幅度下降.     

农杆菌介导法获得小麦转基因植株的研究

从gus基因的瞬时表达入手, 利用不同种类的农杆菌菌株感染小麦不同基因型和同一基因型的不同外植体, 研究了农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效率的影响. 从中优选出了对小麦愈伤组织感染力比较强的农杆菌菌系AGL0和MOG101, 以及高敏感受体基因型Alondra和扬麦158等. 实验结果还表明, 预培养10～15天的幼胚愈伤组织具有     

农杆菌介导FT基因转化嘎拉苹果的研究

用农杆菌介导法对苹果品种嘎拉转化FT基因进行了研究,建立了苹果离体叶片高效再生体系,在含BA 5mg／L＋IAA 0．5mg／L的MS培养基上,以离体叶片远轴面（叶背面）向上,经过14d的暗培养获得再生不定芽和再生植株,再生率达97％。在转基因再生体系中,以头孢噻肟钠500mg／L和卡那霉素5mg／L,作为脱菌培养和选择培养的条件,经过感染携带拟南芥FT基因的农杆菌,获得了一批转FT基因的植株,经PCR检测,目的基因已经整合到苹果基因组中。     

半夏试管块茎直接再生技术的研究

选用半夏的叶片、叶柄为试验材料,设计不同的培养基,研究植物生长物质种类和浓度、糖种类和浓度、叶柄的放置情况及光照与黑暗等条件对直接再生形成试管小块茎的影响。结果表明,叶片直接诱导块茎的适宜培养基为MS附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IAA 和3％蔗糖;叶柄直接诱导块茎的适宜培养基为MS附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L     

农杆菌介导NHX基因转化甘蓝型油菜的研究

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体，通过根癌农杆菌EHA105（Agrobacterium tumefaciens）介导将盐地碱蓬（Suaeda heteroptera）的Na⁺/H⁺反向运输体基因NHX导入新疆主栽油菜1khp11品系中，获得了抗卡那霉素的再生植株，并对影响遗传转化的一些关键因素进行了研究。结果表明,带柄子叶在含有2,4-D的培养基上经过3 d预培养后于浓度OD₆₀₀为0.3～0.4的菌液中浸染7 min, 卡那抗性绿苗率可达8%～9%，经过对抗性植株的PCR检测、点杂交及PCR-Southern杂交证明外源基因已整合到油菜基因组中，为新疆盐碱土上油菜产量的提高提供了新的途径。