NaCl对转P5 CS基因水稻种子萌发的影响

脯氨酸是植物体内非常重要的渗透调节化合物,它的积累可增加植物对干旱、盐碱的耐受能力。P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧基合成酶基因)在植物中催化脯氨酸生物合成的前两部反应,其活性受到脯氨酸含量的反馈抑制。本研究对转P5CS基因的水稻T4代种子与对照在不同浓度的NaCl胁迫下的萌发进行试验。结果表明,随着NaCl浓度的增高,种子萌发受到的抑制越大,但在100 mmol/L时转P5CS的种子萌发率、生理指标、ABA、脯氨酸和可溶性糖的含量显著高于对照,但可溶性蛋白低于对照。说明转P5CS基因的水稻有显著的耐NaCl胁迫作用。     

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。     

盐角草P5CS基因克隆及其在高盐胁迫下的表达分析

△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨酸合成途径中的限速酶,但P5CS基因在调节植物耐盐过程中具体的生物学功能尚不明确.本研究利用RT-PCR方法从盐角草中分离得到一个P5CS基因,并对其进行了生物信息学分析和盐胁迫表达特性分析.结果表明,盐角草P5CS基因的cDNA序列全长为2151 bp,编码716个氨...     

高粱在盐胁迫下特定蛋白的表达及与耐盐性关系的研究

报道了通过统计学上逐步回归的方法,筛选出对植物耐盐性有显著贡献的蛋白质,并应用方差分析探讨上述蛋白质的最佳诱导条件,以便探明盐胁迫一特定蛋白一耐盐性之间的关系。结果表明: 由NaCl诱导的高粱耐盐性是众多蛋白质综合作用的结果,其中不受盐诱导的15. 5 kD根蛋白、受盐诱导的71. 4 kD叶蛋白对高粱耐盐性具有显著正贡     

转PuP5CS基因烟草对低温胁迫的生理响应

以朝鲜碱茅PuP5CS基因(HQ637435)为目的基因,构建了PuP5CS基因的正义表达载体和反义表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,研究了PuP5CS基因对烟草耐寒性的影响。结果显示,低温胁迫下,正义转基因烟草体内可溶性糖、脯氨酸、叶绿素a和叶绿素b的含量均显著高于野生型烟草,丙二醛含量增幅显著低于野生型烟草,提高了转基因烟草的抗寒性,而反义转基因烟草体内各项生理指标变化不明显。     

转入反义ScP5CS基因烟草植株对PEG和NaCl处理的反应

以转入甘蔗脯氨酸合成酶基因ScP5CS反义片段的转基因烟草与野生型烟草为材料,研究PEG6000与NaCl处理对转基因与野生型烟草植株生长及其T0代种子萌发的影响。结果表明,在17mmol/L NaCl与1%PEG6000胁迫下转入ScP5CS反义基因片段的烟草植株矮小,叶片容易发黄,根系发育迟缓,根长缩短;转基因烟草T0代种子在200mmol/L NaCl胁迫时其发芽率明显受到抑制,并随着盐胁迫处理时间达到第55天时,在50mmol/L NaCl胁迫下其叶片严重黄化,而野生型与转入空载体株系则相反。PEG6000处理对转基因烟草T0代种子萌发影响不大。可见,甘蔗ScP5CS基因在烟草中的反义表达,部分抑制了烟草P5CS基因的活力。     

普通菜豆PvP5CS2基因对逆境胁迫的应答

为了探索逆境条件下脯氨酸积累的分子遗传机理, 改善作物的抗逆能力, 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和水杨酸法分别检测干旱、高盐(200 mmol L^-1 NaCl)和冷(4℃)胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2表达量和脯氨酸含量的变化。结果显示, 3种胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中PvP5CS2的转录水平快速上升, 干旱处理4 d, 叶中PvP5CS2表达量达到最大值; 高盐处理下, 叶和根中PvP5CS2的表达高峰分别出现在2 h和6 h; 冷胁迫下, 叶和根中的表达高峰都出现在2 h; 随着胁迫时间的延长, PvP5CS2基因的转录水平逐渐下降。普通菜豆在逆境胁迫下, 幼苗叶和根中脯氨酸大量积累, 积累高峰出现在PvP5CS2基因表达高峰之后。这些结果说明, PvP5CS2基因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导, 脯氨酸积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。PvP5CS2基因在洋葱表皮细胞中的瞬时表达结果显示PvP5CS2蛋白定位在细胞核和膜上。     

转SbPIP1基因小麦植株的获得及发芽期耐盐性鉴定

为了培育耐盐小麦新材料,利用基因枪转化法将海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)水通道蛋白(plasma membrane intrinsicprotein,SbPIP1)基因导入到小麦品种宁麦13和扬麦158中。对两个品种的各2500枚幼胚进行轰击,分别获得抗Basta再生植株237株和108株(筛选标记基因为Bar基因),经PCR鉴定阳性转基因植株分别为30株和7株。用130mg/L Basta除草剂对T1代幼苗进行喷施鉴定,发现T1代幼苗的Basta抗性出现了分离。遗传分析发现76.19%的株系表现为1对基因遗传的3:1分离,为单拷贝的基因导入。发芽期耐盐性分析发现81.22%的转基因株系的盐害指数低于受体宁麦13的盐害指数,耐盐性强于受体宁麦13。这些转基因材料将进一步用于小麦的耐盐分子育种研究。     

普通菜豆PvP5CS2基因对逆境胁迫的应答

为了探索逆境条件下脯氨酸积累的分子遗传机理, 改善作物的抗逆能力, 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和水杨酸法分别检测干旱、高盐(200 mmol L^-1 NaCl)和冷(4℃)胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中脯氨酸合成酶基因PvP5CS2表达量和脯氨酸含量的变化。结果显示, 3种胁迫条件下普通菜豆幼苗叶和根中PvP5CS2的转录水平快速上升, 干旱处理4 d, 叶中PvP5CS2表达量达到最大值; 高盐处理下, 叶和根中PvP5CS2的表达高峰分别出现在2 h和6 h; 冷胁迫下, 叶和根中的表达高峰都出现在2 h; 随着胁迫时间的延长, PvP5CS2基因的转录水平逐渐下降。普通菜豆在逆境胁迫下, 幼苗叶和根中脯氨酸大量积累, 积累高峰出现在PvP5CS2基因表达高峰之后。这些结果说明, PvP5CS2基因的表达受干旱、高盐和冷胁迫诱导, 脯氨酸积累受PvP5CS2基因转录水平的调控。PvP5CS2基因在洋葱表皮细胞中的瞬时表达结果显示PvP5CS2蛋白定位在细胞核和膜上。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

油莎豆耐盐性评估及盐胁迫下幼苗根系转录组学分析

油莎豆是一种综合利用价值高的新型经济作物,抗逆性极强,具有在盐渍化土壤上种植发展的潜力。为明确其耐盐特性,本研究设置5个NaCl浓度(0、0.3%、0.6%、0.9%和1.2%),分析了NaCl胁迫对油莎豆茎豆萌发和幼苗生长过程中形态和生理指标的影响。结果表明,在0.3%和0.6%NaCl胁迫下,茎豆发芽率、幼苗根长和苗高受影响程度较小;根系中膜受损程度指标物丙二醛(MDA)和氧化胁迫物过氧化氢(H2O2)的含量增加不显著,而渗透调节物甜菜碱(GB)、脯氨酸(Pro)的含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性显著提高,整体上受到的盐胁迫伤害较小。而在0.9%和1.2%NaCl胁迫下,盐胁迫伤害十分明显,茎豆萌发和幼苗生长受到严重的抑制。为进一步鉴定油莎豆耐盐相关基因,利用RNA-seq技术检测了0、0.3%和0.6%NaCl胁迫下油莎豆根系的基因表达情况。通过基因差异表达分析、加权基因共表达网络分析(WGCNA)以及GO富集分析发现,24个主要与氧化还原、跨膜转运、几丁质水解相关的GOterms显著富集,涉及了15个显著上调表达基因。其中...     

SeNHX1与GFP融合基因在酵母中表达及其耐盐性表现

通过构建盐角草的液泡型Na /H 反向转运蛋白SeNHX1基因的酵母表达载体,研究该基因对酵母耐盐性的影响.将SeNHX1基凶与荧光报告基因GFP融合,分别构建酵母表达载体pYES2.SeNHX1-GFP、pYES2-SeNHX1和pYES2-GFP,转化酵母W303,诱导3个载体表达,并测定含有不同表达载体的酵母生长曲线.结果表明.荧光显微镜下观察到带有报告基因GFP的2个转化子W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-GFP)均可发出绿色荧光,而没有报告基因的转化了W303(pYES2-SeNHX1)不发出荧光;在含有0.8 mol/L NaCl培养基中培养0～48 h内,W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-SeNHX1)菌株前期生长比对照菌株W303(pYES2-GFP)慢,但在培养48 h后则大大超过对照菌株.表明所构建带有目的基因SeNHX1的酵母表达载体已表达,且证实SeNHXl基因可提高酵母的耐盐性.     

转MvNHX1和MvP5CS基因棉花耐盐抗旱性比较与育种价值分析

通过对花粉管通道法获得的T7转MvNHX1基因的10个棉花株系和转MvP5CS基因的3个棉花株系与对照非转基因棉花D5在温室内盐和干旱胁迫下的发芽率、生理生化指标以及田间花期干旱胁迫下农艺性状和纤维品质进行分析发现:温室内盐和干旱胁迫后,转基因棉花叶片叶绿素含量、脯氨酸含量均高于对照,而丙二醛含量低于对照;田间花期干旱胁迫下,2种转基因植株果枝数、有效果枝数、铃数、有效铃数、铃重、子棉、皮棉、衣分、子指和衣指均高于对照,说明转MvNHX1基因和转MvP5CS基因植株在干旱逆境下的产量高于非转基因;经花期干旱胁迫后,2种转基因棉花的纤维断裂伸长率、短纤维率、马克隆值和纺纱一致性指数优于非转基因棉花D5。综合分析表明:2种转基因棉花的耐盐抗旱性均有提高,其中转MvNHX1基因棉花的耐盐性优于转MvP5CS基因棉花植株,而转MvP5CS基因棉花植株的抗旱性优于转MvNHX1基因棉花植株。     

紫花苜蓿Na+/H+ 逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na⁺的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

异源表达棉花GhPRP5基因增强了拟南芥对盐和ABA的敏感性

富含脯氨酸的蛋白(proline-rich proteins, PRPs)代表一类富含脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白质,最先在伤害诱导的胡萝卜贮藏根中被发现。越来越多的证据显示这类蛋白在应答多种生物和非生物胁迫中起作用。我们之前从棉花cDNA文库中分离了一个命名为GhPRP5的编码富含脯氨酸蛋白的基因,为研究其功能,构建了GhPRP5的过量表达载体,转化拟南芥,获得GhPRP5高表达的8个株系的纯合体。在正常培养条件下,转基因株系和野生型种子的萌发率一致,但盐胁迫和ABA处理显著抑制了转基因拟南芥株系种子的萌发。盐胁迫条件下野生型的绿苗率明显高于转基因拟南芥株系,与正常生长条件相比,ABA处理抑制转基因拟南芥主根伸长的程度更大。利用Quantitative RT-PCR技术分析几个胁迫相关标记基因的表达情况表明,盐和ABA诱导了RD29A、RD29B和KIN1的表达,但诱导水平在转基因株系和野生型中不一样,说明GhPRP5参与调控拟南芥胁迫相关标记基因的表达,但具体参与的胁迫应答信号传导途径仍需进一步研究。     

外源5-氨基乙酰丙酸对盐胁迫下南瓜种子萌发及耐盐性的影响

为探讨外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)对NaCl胁迫下南瓜种子萌发和耐盐性的影响,以“银辉2号”南瓜品种为材料,在不同强度(0,90,180,270 mmol/L) NaCl胁迫下,分别复合(0,10,25,50 mmol/L)的ALA浸种6h,人工气候箱培养5d,研究ALA对南瓜种子发芽率、发芽势及芽苗O2-·产生速率、过氧化产物MDA的积累和超氧物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响.结果表明,180～270 mmol/LNaC1胁迫,极显著抑制了南瓜种子的萌发;10～25 mmol/LALA浸种,显著提高了NaCl胁迫下南瓜种子的发芽率和发芽势,上调了SOD和APX活性,降低了MDA含量;而较高浓度(50 mmol/L) ALA则降低了发芽率和发芽势,对活性氧(ROS)生成的抑制作用和抗氧化能力均下降.总之,10 mmol/L ALA对90 mmol/L NaCl、25 mmol/L ALA对180 mmol/L NaCl胁迫具有显著的促进种子萌发和缓解盐害的作用.     

蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力

Hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因Hrip1转化到拟南芥,对5个T₁代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明Hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L⁻¹ NaCl和50 mmol L⁻¹甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。3周龄的转基因植株在250 mmol L⁻¹ NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L⁻¹ NaCl和200 mmol L⁻¹甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64和1.86倍。说明蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。