猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 kDa。 Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)囊膜糖蛋白GP5编码基因ORF5不同编码区的原核表达能力,利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5′端N片段和缺失跨膜区的3′端C片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行原核表达,结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物,而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33,25,29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRS阳性血清发生阳性反应,C片段反应性稍弱,而N片段未出现阳性反应,证实ORF5基因编码产物的C端在与抗体结合的反应原性方面具有重要作用。     

禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

芸香草CdLEA3基因的克隆及原核表达分析

本研究以芸香草为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术对芸香草CdLEA3基因进行了分离克隆以及原核分析,并进行了生物信息学分析与原核表达分析。结果显示,芸香草CdLEA3基因的cDNA全长为934 bp,含627 bp的最大开放阅读框,编码208个氨基酸;生物信息学分析表明,CdLEA3基因编码蛋白的分子质量预测为21.6 kD,包含75.5%的亲水性氨基酸,不稳定指数为34.5,具有极强的亲水性,属于稳定性强的亲水性蛋白。CdLEA3基因编码蛋白的二级结构主要为α-螺旋结构;SDS-PAGE分析表明CdLEA3蛋白分子质量约为22 kD,且全部在上清液中表达。本研究通过对芸香草CdLEA3基因克隆分析,为进一步研究CdLEA3基因的分子作用机制及功能提供科学依据。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与检测

目的 表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究.方法 根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增.把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定.将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体PGEX-6P-1,再将构建成功的原核表达质粒载体PGEX-6P-VP2转化至大肠杆菌BL21中,进行鉴定、测序、表达.结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与6个VP2基因序列的同源性为98.7%-99.7%.Western-blotting分析显示,表达产物约为90kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性.     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

小反刍兽疫病毒核蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了获得小反刍兽疫病毒特异性抗原N蛋白,用于检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的检测方法的建立,本文根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白核苷酸序列,设计引物,扩增N基因。扩增片段通过NdeI和NotI酶切位点插入表达载体pCold I。重组蛋白通过pCold I载体转化,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,表达产物为58kDa的融合蛋白,可被PPRV感染动物血清识别,重组蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了检测PPRV血清的间接ELISA方法,与国外标准ELISA试剂盒的符合率达98.3,为建立快速检测小反刍兽疫病毒抗体检测方法奠定了基础。     

芒果MiFTs基因家族克隆及其酵母双杂诱饵载体的构建

成花诱导是开花植物生长发育过程中最为重要的一环,而开花整合因子Flowering Locus T(FT)在这一过程中起非常重要的调控作用。目前,FT基因调控芒果成花的作用机制尚不清楚。本研究以‘四季蜜芒’为材料,克隆验证了从转录组测序数据中挖掘获得的3个FT同源基因,命名为MiFT1、MiFT2和MiFT3。生物信息学分析显示,3个MiFTs基因编码区长度分别为588 bp、540 bp和516 bp,分别编码氨基酸196个、180个和172个,分子量分别为48.97 kD、44.71 kD和42.27 kD,等电点分别为4.99、5.06和5.06,3个基因均含有一个保守的PEBP结构域。将MiFT1、MiFT2和MiFT3基因定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,通过菌落PCR和测序进行验证,并成功转化酵母菌株Y2H Gold感受态细胞。对诱饵质粒酵母菌进行自激活和毒性检测,发现pGBKT7-MiFT1、pGBKT7-MiFT2和pGBKT7-MiFT3在酵母菌种均不具备自激活性和毒性。此酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续蛋白互作筛选提供参考。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2 目的蛋白功能,探明CBF2 转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR 技术从基因组DNA 中克隆CBF2 基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2 并转化E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238 个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2 基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2 基因在E. coli Rosetta 中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

玉米ZmCKX基因的克隆及分析

细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。