口蹄疫146S病毒粒子IgG的纯化及其免疫活性的鉴定

用口蹄疫146S病毒粒子(FMDV 146S)免疫家兔产生抗体,待血清效价达到1：64以上分离血清;通过饱和硫酸铵盐析沉淀、Sephadex G-25除盐和DEAE-cellul08e层析等方法纯化血清IgG;用间接ELISA方法检测纯化后的血清IgG免疫活性。证明用离子交换层析法纯化兔抗口蹄疫146S病毒粒子血清IgG效果良好。     

口蹄疫病毒完整病毒粒子定量方法的研究进展

口蹄疫疫苗的有效抗原成分为完整的口蹄疫病毒粒子(146S),疫苗的效力与疫苗中含有的146S具有极大的相关性。因此对疫苗的生产过程及产品进行146S的定量检测是非常重要的环节。目前对146S定量的方法主要是超速离心的方法,除此之外,ELISA检测也越来越受到关注,同时很多研究人员也在积极探索其他更为简便快捷的检测方法。作者主要对各种146S的定量方法作一综述。     

口蹄疫疫苗非抗原蛋白对146S抗原免疫效果的影响

为探究非抗原蛋白对口蹄疫病毒A型(FMDV-A) 146S抗原免疫效果的影响,本研究以小鼠和猪为试验动物,分别制备5组小鼠注射用样品:A组(3μg 146S抗原)、B组(3μg 146S抗原+25μg非抗原蛋白)、C组(3μg 146S抗原+50μg非抗原蛋白)、D组(3μg 146S抗原+100μg非抗原蛋白)及E组(空白对照,PBS);同时制备4组猪注射用样品:A组(18μg 146S抗原)、B组(18μg 146S抗原+400μg非抗原蛋白)、C(18μg 146S抗原+4 000μg非抗原蛋白)及D组(空白对照,PBS)。免疫接种试验动物后,通过淋巴细胞增殖试验及实时荧光定量PCR评价比较不同疫苗样品组小鼠产生的细胞免疫应答水平,同时通过液相阻断ELISA方法检测、评价各试验组动物(小鼠和猪)产生的体液免疫应答水平。小鼠试验结果显示,在免疫后3个检测时间点内,4个试验组中C组的平均抗体水平最高,平均抗体效价分别为4.13、5.83和5.50,而D组的抗体水平最低,平均抗体效价分别为3.46、5.16和4.46;C组细胞增殖能力及Th-1型细胞因子IL-6、IFN-β和TNF-αmRNA表达量均高于其他组。猪试验结果显示,A组和B组间平均抗体水平差异不显著(P>0.05),但A组和B组的平均抗体效价均极显著高于C组(P<0.01)。综合上述结果表明,一定范围内少量非抗原蛋白对FMDV-A 146S抗原的免疫效果没有影响,而高浓度的非抗原蛋白则抑制FMDV-A 146S抗原的免疫效果。     

口蹄疫灭活疫苗抗原稳定性研究进展

口蹄疫是一种感染牛、羊和猪等偶蹄动物、具有高度传染性的动物疫病。疫苗免疫是控制该病的关键措施之一,口蹄疫灭活疫苗在口蹄疫流行地区广泛使用。灭活疫苗中,完整口蹄疫病毒粒子(146S粒子)是至关重要的免疫抗原,它的数量和稳定性决定了疫苗的免疫效果。不同血清型,甚至同型不同毒株的口蹄疫病毒粒子稳定性不同,146S粒子在一定温度、酸、碱条件下容易分解为五聚体(12S粒子),导致疫苗免疫效力大幅下降。近年来口蹄疫病毒结构及其稳定性的分子基础研究取得了一定进展,为研究口蹄疫病毒稳定性提高疫苗质量,开发新型口蹄疫空衣壳疫苗提供了重要的理论基础。本文简要介绍了口蹄疫病毒结构基础、稳定性研究方法和研究进展。为同行了解口蹄疫病毒结构与免疫的关系,评价新型疫苗提供一些参考信息。     

人参皂甙Rb1和黄芪多糖对微血管内皮细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的影响

取中药提取物人参皂甙Rb1和黄芪多糖作用于体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，用硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）、ELISA法测定白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）水平的变化，为分析其免疫作用机制提供试验依据。微血管内皮细胞在人参皂甙Rb1和黄芪多糖的作用下，细胞分泌NO、IL-6和TNF—α均增多，并且随着浓度的增加内皮细胞分泌量也增加。     

对多种口蹄疫疫苗有效抗原（146S）、总蛋白、内毒素三者含量测定的比较研究

对市场上流行使用几种口蹄疫灭活疫苗进行有效146S抗原、总蛋白及内毒素含量测定,同时对疫苗破乳后的水相进行了SDS-PAGE分析。不同疫苗的质量差异极其显著,有效146S抗原含量从未检出至8.53μg/头剂;总蛋白含量从未检出至4 325μg/头剂;内毒素含量从0.55至15.65 EU/头剂。运用SDS-PAGE、Western bolt技术分析表明各种疫苗所含杂蛋白含量及有效抗原量差异较大。部分疫苗的有效146S抗原含量不足,非抗原蛋白含量较大,大多数国产疫苗146S含量与非抗原蛋白之比在0.3%以下,这是造成很多口蹄疫疫苗免疫过程产生的副作用及免疫失败的主要原因之一。     

ELISA用于口蹄疫病毒146S抗原快速定量的研究

口蹄疫病毒的146S抗原是口蹄疫的主要免疫性抗原,对该抗原进行快速准确的定量对口蹄疫疫苗质量监测、新型疫苗开发和抗原研究有重要的意义。本研究利用酶联免疫吸附实验快速敏感的特性建立了定量146S抗原的检测方法,证明抗原含量和OD值表示的ELISA结果有对数线性关系,相关系数为0．98。实验建立了计算机自动计算程序,可以利用统计学方法快速计算出抗原含量,ELISA进行146S抗原定量的方法使用方便,结果准确,具有较高的实用价值。     

应用高效体积排阻色谱法测定市场抽检口蹄疫灭活疫苗中的抗原（146S）含量

应用高效体积排阻色谱法对5批市场抽检口蹄疫灭活疫苗中有效抗原(146S)含量进行检测,并使用口蹄疫O型、A型和亚洲1型抗原测试卡对5批疫苗中的抗原进行鉴别。结果显示高效体积排阻色谱法测定146S标准品浓度与峰面积线性关系良好,5批疫苗均检测到146S特征吸收峰(R2=0.9937,n=7),经计算得到灭活疫苗中有效抗原含量分别为2.05、3.73、2.03、4.87、3.41μg/m L;使用抗原测试卡鉴别了5批疫苗中的抗原类型。结果表明,高效体积排阻色谱法简便、高效,准确度较高,有望在口蹄疫灭活疫苗的质量控制中发挥重要作用。     

LPS对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO的影响

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一种由血管内皮细胞分泌的内源性血管舒张因子。NO作为一种重要的信使分子具有舒张血管、神经传递以及杀灭微生物和肿瘤细胞等多种生物学功能。     

LLO对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO和ET-1的影响

为探讨李斯特菌溶血素(LLO)导致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)损伤的作用机制,将体外培养的RIMVECs分为对照组和LLO组,观察细胞形态变化,测定细胞生长情况,并检测细胞培养上清液中NO、ET-1浓度变化。结果表明:LLO组RIMVECs的细胞间隙变大,有大量细胞碎片漂浮;当LLO浓度达到50ng/m L以上时,测得细胞增殖(OD值)均呈极显著下降(P0.01);12 h内,NO、ET-1分泌量高于正常水平。试验表明,LLO引起RIMVECs细胞因子NO、ET-1分泌量升高,导致细胞微环境紊乱,是LLO导致肠黏膜微血管内皮细胞损伤的机制之一。     

重组白介素-2增强口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究

通过研究重组白细胞介素-2（IL-2）对口蹄疫病毒（FMDV）多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为 FMDV 表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性 Balb／c 小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪 IL-2的重组腺病毒（rAd5poIL-2）和串联表达 FMDV 多表位基因的重组腺病毒（rAd5EGS）,第2、3和4组分别注射 rAd5EGS、灭活疫苗和 PBS,间隔2周免疫1次,共免疫3次。首免后每周采血分离小鼠血清,通过 ELISA 检测血清中特异性 IgG;首免后6周检测血清中抗体亚型 IgG1、IgG2a 及细胞因子 IL-4和 IFN-γ的表达水平,同时分离脾细胞,MTT 法检测淋巴细胞增殖指数。结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2和rAd5EGS 既能增强 rAd5EGS 诱导小鼠特异性 IgG、IgG1和 IgG2a 的分泌,又能增强其诱导淋巴细胞增殖能力,且免疫效果强于灭活疫苗;细胞因子检测结果显示,联合免疫 rAd5poIL-2后能增强 rAd5EGS 诱导小鼠 IL-4和 IFN-γ的分泌,且其诱导 IL-4和 IFN-γ分泌能力也强于灭活疫苗。说明重组 IL-2能有效增强FMDV 多表位疫苗诱导抗体分泌能力和细胞免疫应答,rAd5poIL-2有望作为 FMDV 表位疫苗的候选佐剂。     

微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述

微血管内皮细胞在许多病理生理过程中起殴丶缘淖饔?应用体外培养的微血管内皮细胞,不仅广泛应用于微循环系统对不同生理或病理刺激的反应,也可阐明伴随微血管功能障碍和组织损伤的某些疾病的病理机制,所以分离培养动物及人各个器官组织微血管内皮细胞的报道日渐增多.微血管内皮细胞分离方法主要有3种,包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法,每种方法各有利弊.微血管内皮细胞一般通过其表面的血管紧张素酶、摄取乙酰基低密度脂蛋白和表达Ⅷ因子相关抗原进行鉴定.目前从不同组织器官分离培养微血管内皮细胞的方法已经比较成熟.     

高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的疫苗前处理方法比较

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146S抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破乳后水相得率分别为:正戊醇38%~49%,正丁醇42%~44%,三氯甲烷50%;9批疫苗的色谱结果均检测到146S特征峰,146S含量在0.7~12.5μg/mL,3次测定的相对标准偏差最大值为4.0%,9批疫苗不同前处理方法的检测结果均值具有统计学意义,三氯甲烷组与正戊醇组数据一致性强,正丁醇组测定值偏低。使用三氯甲烷对疫苗进行破乳,不仅操作简便快速,而且破乳水相得率稳定,是最优的破乳方法。实验进一步优化了口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量检测的高效体积排阻色谱法,为该方法的科学应用提供了数据支撑。     

黄芪多糖对体外培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞增殖的影响

研究黄芪多糖对体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMMVECs）增殖的影响。应用不同浓度的黄芪多糖作用于体外培养的RIMMVECs。通过MTT法检测黄芪多糖对RIMMVECs增殖的影响。不同浓度的黄芪多糖对细胞增殖的影响不同:黄芪多糖浓度在25～800 mg/L时可明显促进细胞的增殖（P<0.05或0.01）;浓度为1.6×10³ mg/L时对细胞的增殖无影响;浓度在3.2×10³～25.6×10³ mg/L时对细胞生长具有抑制作用（P<0.05或0.01）。黄芪多糖有促进体外培养RIMMVECs的增殖作用,此作用对保护内皮损伤、加速内皮修复有重要作用。     

Enolase在鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭脑微血管内皮细胞中的作用

旨在明确鸭疫里默氏杆菌烯醇化酶(Enolase)在其侵袭鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)以及血脑屏障(BBB)中的作用。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为亲本株,利用同源重组和结合转移的方法构建enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase,并测定RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase对DBMEC黏附和侵袭能力的差异;用上述菌株感染雏鸭,测定雏鸭血液和脑组织中的载菌量。结果表明,与亲本株RA-LZ01相比,缺失株ΔEnolase对DBMEC的黏附率和入侵率均极显著降低;回复株cΔEnolase恢复了对DBMEC的黏附和入侵能力。感染RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株的雏鸭的血液载菌量无显著差异;与感染RA-LZ01和cΔEnolase菌株的雏鸭相比,感染ΔEnolase菌株的雏鸭脑组织中的载菌量极显著降低。以上结果说明,Enolase与鸭疫里默氏杆菌黏附和入侵DBMEC以及入侵雏鸭脑组织显著相关,可能为介导鸭疫里默氏杆菌突破鸭血脑屏障的毒力因子。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒-脂多糖刺激对中性粒细胞黏附猪肺微血管内皮细胞的影响

【目的】 研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单独和联合脂多糖(LPS)刺激对肺脏募集中性粒细胞(Neu)的影响, 以及猪肺微血管内皮细胞(MVECs)在其中的作用。【方法】 取约10日龄仔猪的肺脏组织, 采用Ⅱ型胶原酶消化和差速贴壁法, 分离培养原代MVECs, 采用密度梯度离心法分离猪外周血Neu; 以PRRSV HN株或PRRSV-LPS刺激Neu和MVECs后, 将Neu加入培养MVECs的培养板, 孵育1 h, 4%多聚甲醛固定, 瑞氏染色, 观察并计数分析各组黏附的Neu数量; 采用免疫细胞化学染色法检测MVECs对P-选择素和E-选择素的表达; 采用虎红溶液染色法测定分析P-选择素和E-选择素抗体封闭MVECs时, PRRSV HN株或PRRSV-LPS刺激对Neu黏附于MVECs数量的影响。【结果】 分离培养的MVECs呈CD34免疫荧光染色阳性, 阳性率约为92%;PRRSV HN株刺激18 h, 黏附于MVECs的Neu数量显著增加(P<0.05);PRRSV-LPS联合刺激时, 黏附的Neu数量显著多于LPS单独刺激(P<0.05);PRRSV或PRRSV-LPS刺激Neu和MVECs二者时, 黏附Neu数量的增加比单独刺激MVECs或Neu更明显; 免疫细胞化学染色显示, MVECs强阳性表达P-选择素和E-选择素; 用P-选择素和E-选择素抗体封闭MVECs时, PRRSV或PRRSV-LPS刺激诱导的Neu黏附增加呈不同程度下降, E-选择素封闭时具有显著差异(P<0.05)。【结论】 PRRSV感染能促进Neu与MVECs黏附, 亦能增加后继LPS刺激时黏附的Neu数量, MVECs表达的E-选择素是介导PRRSV致Neu黏附增加的重要分子之一。     

口蹄疫病毒灭活疫苗中VP1基因RNA抽提方法的建立

本试验提取疫苗种毒、BEI灭活病毒和白油乳化灭活疫苗病毒中的RNA,并就VP1基因进行了RT-PCR扩增、核酸序列测定和序列比对分析。结果显示,3种来源的VP1基因片段长度均为813 bp,与预期的目标相符,核苷酸序列显示3种方法处理的病毒VP1同源性为100%。说明灭活剂BEI和乳化工艺没有全部破坏口蹄疫病毒VP1基因核酸,为检测疫苗毒株的核酸序列建立了一种方法。