水稻OsENO2-2基因过表达对水稻抽穗期的影响

【目的】 OsENO2-2是OsENO2通过可变剪切产生的短转录本,其cDNA序列从粳稻中花11中分离获得。本研究的主要目的是初步分析OsENO2-2在水稻抽穗期调控中的作用。【方法】 构建了OsENO2-2的超量表达载体,获得转基因植株,通过对表型的观察和统计,分析目的基因在过量表达条件下的功能,并利用反向遗传学方法验证该基因的功能。【结果】 OsENO2-2过量表达导致水稻在长日照条件下的抽穗期推迟,而短日照条件下抽穗期无明显变化。通过qRT-PCR方法对水稻开花关键基因的检测发现,在长日照条件下,RFT1的表达量在超表达材料中显著下调,其他开花重要基因表达量在野生型和超表达材料中没有显著变化;而在短日照条件下,所有检测基因的表达量在野生型和超表达材料中均没有显著变化。【结论】 在长日照条件下,OsENO2-2主要通过调控RFT1基因的表达来调控水稻抽穗期。     

农杆菌介导的水稻Waxy基因过量表达的初步研究

采用RT-PCR技术克隆水稻Waxy基因,并构建该基因的过量表达载体,在农杆菌介导下利用建立的水稻遗传转化体系将目的基因转入水稻。转基因水稻经PCR检测及实时定量PCR拷贝数检测均表明外源基因已成功导入水稻,且多数为单拷贝插入。半定量PCR检测结果显示,导入水稻的外源Waxy基因已成功表达,并使得该基因的表达量较对照有明显提高。水稻Waxy基因过量表达载体的成功转化,将为该基因功能的深入研究及水稻直链淀粉合成的调控奠定基础。     

水稻ABCB转运蛋白基因的分子进化和表达分析

系统鉴定了水稻和拟南芥中27个和29个ABC家族B亚族(ABCB)基因,发现其外显子数目、编码蛋白质的长度和分子量在两种植物中均存在较大变异,而等电点分布的变化较小。系统发育分析把该亚族蛋白分为4个亚组,说明其功能可能已经发生了分化;在水稻和拟南芥中各鉴定了6对和9对旁系同源基因,说明单、双子叶植物分离之后,该亚族在水稻和拟南芥中均以物种特异的方式进行了扩张。片段复制和串联重复是水稻ABC家族扩张的主要机制。多序列比对显示,核苷酸结合域(NBD)的Walker A、Walker B和ABC域基序均高度保守,而Q环和H环的保守性略差;跨膜结构域(TMD)在不同蛋白之间和同一蛋白内没有明显的保守性。表达模式分析表明,水稻ABCB基因的表达具有明显的组织特异性,不同基因的表达特征已经发生分化。非生物胁迫下的表达分析显示多数水稻ABCB基因受到至少一种非生物胁迫因素的调控。旁系同源基因Ka/Ks分析表明,净化选择在水稻ABCB基因复制后功能的保留中发挥了重要作用。     

4个水稻线粒体丙酮酸激酶基因(mtOsPKs)表达分析

丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)为催化糖酵解途径中最后一步反应关键酶,是植物能量释放利用的关键步骤。本研究采用生物信息学方法对水稻基因组进行扫描,获得10个具有PK极保守区域(PK-PK-C)的基因。进行氨基酸序列比对结果表明该家族所有基因的氨基酸一致性为38.4%,系统进化树分析结果也暗示该家族存在4对旁系同源基因;MEME程序分析结果表明该家族都具有完全保守的基序,这些基序排列次序基本相同。对预测定位在线粒体的4个PK基因进行半定量RT-PCR分析,结果表明,Os04g0677500基因在各器官的表达量都很高,呈组成性表达;而Os10g0571200在各器官基本不表达;Os01g0276700和Os03g0672300表达在各器官中存在差异性。4个mtOsPKs表达情况的多样性可能是水稻在进化中适应不同生存环境而产生,使线粒体作为能量加工厂的正常运转提供保证。     

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(RsPhm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,RsPhm基因的DNA和cDNA全长序列分别为2628 bp和1983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,RsPhm基因在立枯丝核菌(R. solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过qRT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌RsPhm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高RsPhm基因的表达量,在12.5 µg/mL浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25 µg/mL和50 µg/mL浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100 µg/mL浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了RsPhm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌RsPhm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的克隆及表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内信号转导的重要组分,受多种生物及非生物胁迫的刺激活化。利用RT-PCR方法克隆了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的cDNA序列(GenBank登录号为GQ265780)。该序列全长1660bp,包含1个1629bp的开放阅读框,编码蛋白由542个氨基酸组成,包含典型的蛋白激酶结构域及磷酸化位点TDY基序。序列比对和分析显示,OsMPK14基因位于水稻第5染色体上,其编码区由9个外显子和8个内含子组成。采用半定量RT-PCR技术,检测了光照、低温、高盐、干旱和脱落酸对该基因在水稻地上部分和根中表达的影响。结果显示高盐、低温、脱落酸都能上调其表达,而干旱对其表达具有微弱的抑制效应,光照可以降低该基因在水稻地上部分的表达,提高在根中的表达。基因可能在水稻非生物胁迫的应答中具有重要作用,其表达受多种因素调控。     

水稻OsWRKY89基因启动子的表达特性

利用PCR技术从粳稻品种秀水11中扩增了转录因子WRKY89编码区5′上游大小为1470 bp的调控序列,命名为OsW89p,将它与GUS基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法将载体转化水稻,GUS组织化学分析结果表明,OsW89p驱动的GUS基因在转基因植株各个时期的叶、茎和叶鞘中均有表达;在花器的外稃和花药中有活性而在花粉和成熟种子中均无活性;种子萌发时在胚中有活性;2.5叶期时在种子根、不定根和侧根中均有活性但根尖中无活性,5叶期时根部只有侧根中有活性。分析了GUS在T1代苗期时的诱导表达特性,GUS荧光测定结果表明：1) GUS的表达被茉莉酸甲酯增强,诱导倍数是4.0,被2,4 D抑制,水杨酸对OsW89p的表达几乎没有影响;2) 用NaCl和PEG这2种非生物因子处理转基因苗根部,根中GUS的表达被抑制,但叶片中可被诱导增强;3) GUS的表达可被紫外线照射、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理这4种非生物逆境因子增强,其中以紫外线照射处理的诱导倍数最高。     

水稻条纹叶和白穗基因SLWP的定位及变异分析

【目的】对叶绿体发育相关基因进行克隆和功能分析,为解析叶绿体功能奠定分子基础。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)处理籼稻9311获得一个条纹叶和白穗突变体slwp,通过色素分析和农艺性状观察分析该突变体的表型,通过图位克隆方法分离该基因,进一步利用定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】突变体slwp从2叶期开始至抽穗期表现出条纹叶表型,抽穗后幼穗白化,光合色素含量明显低于野生型;株高降低、抽穗延迟、产量降低等表型。该突变性状为单隐性核基因控制,该基因定位于水稻第6染色体短臂C6-4和N14标记之间0.91 Mb区间内。基因组测序表明核糖核苷二磷酸还原酶小亚基基因(RNRS1)编码区第776位点发生单碱基替换,导致甘氨酸突变为天冬氨酸;该基因与已报导的水稻基因St1、Gws和St-wp为等位基因。通过对这4个等位基因的突变位点和表型进行分析,总结了该基因不同位点突变对植株表型的影响以及籼粳之间的差异。表达分析显示与叶绿素合成有关的基因受到不同程度调控,叶绿体发育第一和第二阶段基因上调表达,光合作用相关基因均下调表达。【结论】本研究分析了SLWP(RNRS1)基因不同位点的变异对水稻表型的影响,相关结果加深了对RNRS1基因功能的认识,有助于阐明叶绿体发育的分子机制。