水稻粉质皱缩胚乳突变体fse4的表型分析与基因克隆

【目的】水稻种子主要以淀粉形式储藏能量。淀粉合成需要多种酶类和调控因子参与，机制较为复杂。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体，克隆和鉴定新的调控淀粉合成相关基因，旨在为研究淀粉合成及其调控提供理论依据。【方法】从化学诱变剂甲基亚硝基脲（1-methyl-1-nitroso-urea, MNU）处理的宁粳3号(Ningjing 3, WT)突变体库中筛选到一个能稳定遗传的胚乳粉质皱缩突变体，命名为fse4 (floury and shrunken 4 )。与籼稻品种Dular杂交获得F1种子（F2），通过图位克隆的策略确定FSE4候选基因。利用杂合植株（FSE4fse4）分离出的粉质种子，观察形态学特征，分析其理化性质。使用扫描电镜和半薄切片技术观察胚乳结构。使用qRT-PCR和免疫印迹分析淀粉合成相关基因表达模式和淀粉合成相关酶类的蛋白积累量。利用全自动氨基酸分析仪测定成熟胚乳各氨基酸含量。【结果】突变体fse4籽粒宽度、厚度以及千粒重显著下降，同时胚乳中总淀粉、总蛋白、直链淀粉含量亦显著下降，而脂肪含量显著上升；淀粉黏度、崩解值和消减值显著低于野生型。突变体fse4中多为单粒型淀粉颗粒，且排列分散。FSE4定位于第5染色体长臂约252 kb的区间内，测序发现编码Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 （Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS）第1外显子上发生单碱基替换，导致一保守的氨基酸发生变异。突变体fse4中大部分淀粉合成相关基因表达量下调，多种淀粉合成相关蛋白积累量减少。突变体fse4米粉中多种氨基酸含量发生显著变化，游离氨基酸含量是其野生型的3.6倍。此外，外源喷施脯氨酸能部分恢复突变体fse4种子萌发缺陷表型。【结论】FSE4编码脯氨酸合成关键限速酶P5CS，该基因对胚乳中氨基酸的合成及代谢起重要的调控作用，并影响淀粉的合成与积累。     

水稻低淀粉粘滞性突变体的获得与特性分析

利用300 Gy [sup]60[/sup]Co-γ射线辐照早籼稻品系W8-1干种子,诱发产生了低淀粉粘滞性突变体[i]lsv-1[/i]。对其淀粉特性分析表明,突变体的表观直链淀粉含量、胶稠度和碱消值与原亲本相仿,但最高粘度、冷胶粘度、崩解值和消减值明显小于原亲本,达最高粘度时间更短,开始糊化温度更高。突变体糊化后的米粉特性和胚乳内淀粉粒的形态与原亲本显著不同。     

富含抗性淀粉水稻突变体的淀粉特性

 从杂交水稻优异恢复系R7954诱变筛选了1个富含抗性淀粉的突变体RS111。该突变体热米饭中抗性淀粉的含量高达7.0%，是其野生型的2.4倍。突变体的淀粉颗粒形态、DSC和多晶衍射的曲线和参数与野生型明显不同，表现为淀粉颗粒大小较为一致，圆形和卵形淀粉颗粒所占比率较高，溶晶起始温度(TO)、最高温度(TP)、回落温度(TC)、焓变(ΔHGEL)及结晶度更低。突变体的表观直链淀粉、粗脂肪和粗纤维的含量显著提高。     

MNU诱发的水和稻巨大胚,甜胚乳两个突变体的RFLP鉴定

利用均匀分布于水稻１２条染色体上的７２个ＲＦＬＰ标记与８种限制性内切酶的不同组合,对化学诱变剂ＭＮＵ诱变产生的巨大胚、甜胚乳两个突变体及其原始品种金南风三者之间进行ＲＦＬＰ分析。结果表明：巨大胚突变体与金南风、甜胚乳突变化与金南风以及两突变体之间的多态性分别为８．３％、５．６％和１２．５％。巨大胚和甜胚乳两突变体基因突变频率分别为０．０２２７和０．００７０。根据揭示多态性的限制性内切酶的数量可将产     

面包小麦（Triticum aestivumL）的蜡质胚乳突变体及其淀粉特性

利用甲基磺酸乙酯对ｃｖ．Ｋａｎｔｏ１０７种子进行处理,已育成两个面包蜡质小麦品系Ｋ１０７ＷＸ１和Ｋ１０７ＷＸ２。约２０００粒栽培品种种子浸在溶有０．５％ＥＭＳ的７％酒精溶液中４ｈ后播在温室里。从１８７２株Ｍ１代植株中收获１０６３４粒Ｍ２代种子。用碘－碘化钾溶液４０００粒Ｍ２代种子的胚乳末端横截面进行染色,其中两粒种子呈棕红色。因为这两粒种子的剩余部分繁衍出的Ｍ３代及Ｍ４代种子仍表现出蜡质胚乳的独特     

MNU诱发的水稻巨大胚、甜胚乳两个突变体的RFLP鉴定

利用均匀分布于水稻 1 2条染色体上的 72个 RFL P标记与 8种限制性内切酶 (Eco R 、Eco R 、H ind 、 Dra 、 Sca 、Xba 、Bam H 和 Bgl )的不同组合 ,对化学诱变剂 MNU诱变产生的巨大胚、甜胚乳两个突变体及其原始品种金南风三者之间进行 RFL P分析。结果表明 :巨大胚突变体与金南风、甜胚乳突变体与金南风以及两突变体之间的多态性分别为 8.3%、5 .6 %和 1 2 .5 %。巨大胚和甜胚乳两突变体基因突变频率分别为 0 .0 2 2 7和 0 .0 0 70。根据揭示多态性的限制性内切酶的数量可将产生的突变大多归为点突变     

水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展

淀粉作为稻米最主要的储藏物质,其生物合成过程直接影响水稻的产量和品质。水稻淀粉的生物合成在造粉体中通过一系列酶促反应完成。本文综述了淀粉合成过程中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(BE)及淀粉脱支酶(DBE)的结构、功能以及各酶之间的相互作用的最新研究进展,以期为稻米品质改良提供理论参考依据。     

水稻胚乳外观云雾性状形态基础及其快速识别条件分析

以早籼稻新品种（系）、杂交水稻不育系、恢复系及其衍生的部分杂交组合为材料进行研究，发现云雾性状是低表观直链淀粉含量品种（系）特有的胚乳外观，其形成的原因和胚乳内淀粉的形态和结构有关。种子老化试验表明，种子水分和老化是快速识别云雾性状的两个重要条件。育种实践中可采用高温烘干和高温保湿预处理两种方法来快速识别胚乳云雾性状，并以此作为标记，早期特异性剔除低表观直链淀粉材料。     

水稻白条纹突变体st13的表型分析及基因定位

【目的】叶色突变相关基因鉴定和克隆有助于研究光合作用,补充并完善叶绿体发育机理和色素合成代谢途径,为开展水稻的高光效育种提供理论依据。【方法】从粳稻品种Dongjin的组培后代中分离出一个白条纹突变体st13,成熟期测定野生型和st13的主要农艺性状,苗期测定色素含量并观察叶绿体的超微结构;将st13和Dongjin进行正反交,观察F_1植株表型,并对F_2表型分离进行卡方检验,对st13进行遗传分析;利用st13×南京11(籼稻品种)的F_2和F_(2:3)群体,对st13突变基因定位;采用qPCR分析叶绿体发育和叶绿素合成相关基因在st13与野生型相对表达量。【结果】与野生型Dongjin相比,该突变体的株高、单株有效穗数、穗长、结实率和千粒重等主要农艺性状显著下降。苗期的色素含量降低,分蘖期无差异。突变体的叶绿体中既有含丰富的类囊体膜结构的正常叶绿体,也存在无类囊体结构的叶绿体。遗传分析和基因定位结果表明,st13的突变表型受1对隐性核基因控制,突变基因位于第3条染色体长臂InDel(Insertion-Deletion)标记I3-21和I3-22之间。进一步在这两个标记之间设计了6对InDel标记,最终将基因定位在94kb区间内,此区间共有8个候选基因。【结论】这8个候选基因中,有5个假定的蛋白,其他三个都是有功能注释的蛋白,而这三个蛋白在水稻中均未见报道,因此,st13突变是由一个新的叶色基因突变引起的;同时st13中叶绿体发育、叶绿素合成和光合系统相关基因的表达也发生了显著改变,推测ST13可能是调控叶绿体发育的关键基因。     

Phenotypic Analysis and Gene Cloning of Rice Floury Endosperm Mutant fse4

【Objective】Starch is the main energy reserve of rice endosperm. The biosynthesis of starch is complex, requiring a large number of synthetic enzymes and regulators. Screening rice endosperm defective mutants and cloning the underlying genes will lay theoretical basis for starch biosynthesis and its regulation. 【Method】 A stable genetic floury and shrunken endosperm mutant termed as fse4 (floury and shrunken4) were obtained from the mutant library of Ningjing 3 (WT), which was induced by N-methyl-N-nitrosourea (MNU). An F2 mapping population was generated by crossing the fse4 mutant with Dular (an indica rice variety) and the gene was finally isolated. The floury seeds segregated from the fse4 heterozygous plants were used to observe the morphological features, and the physicochemical properties of the brown rice flour were analyzed. The endosperm structure was observed with a scanning electron microscopy by the semi-thin section technology. The expression of starch synthesis related genes during grain filling was determined by qRT-PCR; Immunoblotting was used to detect the accumulation of proteins related to starch synthesis. The amino acids contents of each mature endosperm were determined with the fully automatic amino acid analyzer.【Result】The 1000-grain weight and grain size were significantly reduced in fse4. Compared with WT, the contents of total starch, amylose and total protein were signi?cantly lower in fse4, while the lipid content was signi?cantly higher. The starch viscosity, breakdown viscosity and setback viscosity of the fse4 mutant were lower than WT. The endosperm of the mutant had many single dispersed starch granules with large spaces between each other. Using 1568 recessive individuals, FSE4 was narrowed down to a 252 kb region. Sequencing revealed a single base substitution in the first exon of the delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS), resulting in a conserved amino acid variation. Most of the genes related to starch synthesis were downregulated in fse4 and the protein accumulation related to starch synthase were reduced. The contents of various amino acids in fse4 rice flour were increased or decreased, the total free amino acids contents in fse4 seeds was 2.6 times higher than those in WT. Exogenous proline was applied during the germination of fse4 seeds, and the embryonic lethal phenotype was partially recovered.【Conclusion】FSE4 encode the key rate-limiting enzyme P5CS of proline synthesis, which plays an important role in the biosynthesis and metabolism of amino acids in endosperm and affects the accumulation of starch.     

水稻短根毛突变体ksrh1的遗传分析和基因定位

从EMS诱变的籼稻品种Kasalath突变体库中筛选获得了一个短根毛突变体,命名为ksrh1。该突变体在苗期表现为根毛变短,除此之外其表型与野生型没有显著差异。遗传分析表明,该突变性状受1个隐性单基因控制。将突变体ksrh1与粳稻品种日本晴杂交构建F2定位群体,利用已公布的水稻SSR标记和自行设计的STS标记对突变位点进行基因定位,最终将KSRH1定位在水稻第1染色体长臂上的S3578和S3584之间,物理距离约为67kb。     

鸟苷酸激酶OsGK1对水稻种子发育至关重要

【目的】对水稻粉质皱缩突变体fse2进行表型分析及基因克隆,为阐明水稻淀粉合成机制以及胚的发育奠定基础。【方法】fse2来自粳稻品种滇粳优1号的MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)诱变突变体库。本研究考查了突变体fse2籽粒的理化性状,利用扫描电镜和半薄切片观察了淀粉颗粒的结构;构建了fse2与N22的F₂群体,通过图位克隆及转基因互补验证确定目标基因;通过qRT-PCR以及GUS活性染色对FSE2进行组织表达分析;免疫印迹分析了突变体中淀粉合成相关基因以及线粒体基因的蛋白变化。【结果】fse2籽粒粉质皱缩,千粒重显著下降;胚乳中淀粉颗粒变小变圆,排列松散,不能形成正常的复合淀粉颗粒;突变体中总淀粉、直链淀粉含量均显著下降,脂肪含量显著上升,突变体淀粉的糊化特性发生明显改变。FSE2编码一个线粒体和质体双定位的鸟苷酸激酶(guanylate kinase),命名为OsGK1。OsGK1在各器官中组成型表达,并在花后6 d的胚乳中表达水平最高。突变体胚乳中淀粉合成相关蛋白水平显著降低,尤其是AGPS2b和PHOI。此外,突变体fse2的胚发育严重受损,导致种子纯合致死;线粒体定位的AOX积累显著增强,而野生型中几乎检测不到,表明线粒体呼吸途径受损。【结论】由于OsGK1的功能缺陷,导致水稻种子中线粒体和造粉体发育异常,进而产生了胚致死以及胚乳粉质皱缩的表型,因此OsGK1对水稻种子的发育至关重要。     

Transferring Translucent Endosperm Mutant Gene Wx-mq and Rice Stripe Disease Resistance Gene Stv-bi by Marker-Assisted Selection in Rice (Oryza sativa)

A high-yielding japonica rice variety, Wuyunjing 7, bred in Jiangsu Province, China as a female parent was crossed with a Japanese rice variety Kantou 194, which carries a rice stripe disease resistance gene Stv-bi and a translucent endosperm mutant gene Wx-mq. From F2 generations, a sequence characterized amplified region (SCAR) marker tightly linked with Stv-bi and a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker for Wx-mq were used for marker-assisted selection. Finally, a new japonica rice line, N...     

水稻脆秆突变体bc1-wu3的鉴定与基因克隆

【目的】茎秆机械强度与植株抗倒伏性直接相关。发掘脆秆突变体,克隆其相关基因有助于了解茎秆机械强度遗传机制,为抗倒伏育种提供理论依据。【方法】在经~(60)Co-γ诱变的粳稻品种武育粳3号后代群体中获得一个脆秆突变体,命名为bc1-wu3(brittle culm 1 from Wuyujing3),以突变体bc1-wu3为母本,Kasalath为父本构建相应的F_2分离群体,采用图位克隆的方法定位相应脆秆基因。【结果】与野生型相比,突变体的叶片、叶鞘、茎秆等组织在全生育期始终表现为脆性,易折断;穗长和粒长显著降低,粒宽显著增加。茎秆细胞细胞壁糖成分测定表明,细胞壁中纤维素含量极显著下降,而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加。茎秆切片观察发现突变体茎秆的厚壁细胞层数减少,厚壁细胞细胞壁极显著变薄。遗传分析表明,bc1-wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。采用图位克隆的技术将该基因定位于第3染色体标记MK12与MK18之间,物理距离为57 kb,在此定位区段内包含1个已克隆的脆性基因BC1(LOC_Os03g30250)。测序结果表明,突变体bc1-wu3中BC1基因第2外显子内(CDS 659处)有1个碱基的替换(G-T),导致编码氨基酸由半胱氨酸变异为苯丙氨酸。实时荧光定量PCR结果表明,BC1基因在脆秆突变体bc1-wu3茎秆中的表达量显著降低。【结论】据此推断本研究中定位的脆秆基因bc1-wu3为BC1新等位基因。相关结果加深了对BC1基因功能的认识,有助于阐明水稻茎秆强度遗传机制。