粉纹夜蛾颗粒体病毒增效因子C-末端片段的克隆表达及其生物活性初步测定

昆虫杆状病毒增效蛋白（ｅｎｈａｎｃｉｎ）也称病毒增效因子（ｖｉｒａｌｅｎｈａｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＶＥＦ）,是由某些杆状病毒基因编码具有促进核型多角体病毒（ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ,ＮＰＶ）感染的一类金属蛋白酶［１］,具酯酶活性［２］。增效因子在颗粒体病毒、昆虫痘病毒［３］及舞毒蛾核型多角体病毒（ＬｙｍａｎｔｒｉａｄｉｓｐａｒＭＮＰＶ）［４］均有发现。粉纹夜蛾颗粒体病毒（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉｇｒａｎｕｌｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＴｎＧＶ）ＶＥＦ基因的开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａ…     

小菜蛾颗粒体病毒增效基因的初步研究

小菜蛾颗粒体病毒增效基因的初步研究①吕颂雅孟小林徐进平郜金荣叶林柏（武汉大学病毒研究所,武汉４３００７２）ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＳＴＵＤＹＯＮＴＨＥＳＹＮＥＲＧＩＳＴＩＣＦＡＣＴＯＲＧＥＮＥＯＦＴＨＥＰＬＵＴＥＬＬＡＸＹＬＯＳＴＥＬＬＡＧＲＡＮＵＬＯ...     

棉铃虫核多角体病毒的生物活性测定

将棉铃虫Heliothis armigera核多角体病毒滴在人工饲料上,让其渗透到饲料内,再放3龄初棉铃虫幼虫,单个饲养,对我所分离的S01—43棉铃虫核型多角体病毒(单粒包埋病毒)进行了生物活性测定。剂量与死亡率回归方程式为y=3.3387 0.484x,LD_(50)值为2707PIB/克饲料,95％的置信限为1134—6455 PIB/克饲料。5×10~4和5×10~5PIB/克饲料的LT_(50)值分别为7.36和6.27天。在冰箱(4℃)保藏3年的S01—43核多角体病毒LD_(50)活性丧失79.03％,而在室温(大约平均22℃)保藏3年的LD_(50)活性丧失91.21％。     

颗粒体病毒防治菜青虫初步研究

五十年代初,国外报导了菜青虫Peris rapae发生颗粒体病毒病。此后不少工作者以引入种群、诱导流行病或喷雾防治等方法,用此种病毒防治菜青虫,均获得良好结果。我国1972年在广州发现了菜青虫颗粒体病毒,近年又相继在各地发现。我们于1978年春季开始进行颗粒体病毒防治菜青虫的试验,现报导部分结果。     

茶蚕颗粒体病毒及其利用研究

1980年从安徽舒城县晓天茶园的茶蚕罹病虫体中分离获得一种颗粒体病毒,经鉴定为茶蚕颗粒体病毒(AbGy),为我国首次发现。对茶蚕3龄幼虫的半致死浓度LC_(50)为1.23×10~7mg/ml,半数死亡时间LT_(50)为5.4～8天。经感染试验,以1龄幼虫最敏感,感病死亡率随病毒浓度增大而相应提高。在感染12种昆虫中,只感染茶蚕,对桑蚕及天敌昆虫安全无伤害作用。AbGV制剂经田间防治试验示范结果,防治适期以1～2龄为宜,每亩喷施AbGV有效剂量为100～200mg,防治效果可达75.5％～97.45％,若与微量化学农药混用则有明显增效作用,病毒后效作用长达2～3年,自然感病死亡率18.76％～55.94％,AbGV的防治效果显著。     

拒食蛋白XnAFP2三个结构域片段的表达及其生物活性分析

嗜线虫致病杆菌北京变种Xenorhabdus nematophila var. pekingensis CB6菌株产生的蛋白XnAFP2对多种昆虫有拒食活性。生物信息学分析表明,XnAFP2包含DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ3个功能结构域。为确定其主效活性区域,分别对3个结构域进行了克隆、表达和生物活性测定。结果表明,3个蛋白片段对棉铃虫Helicoverpa armigera3龄幼虫的生长抑制率分别为17.4%、39.8%和20.2%,对玉米螟Ostrinia furnacalis3龄幼虫的生长抑制率分别为20.2%3、8.6%和21.7%,对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫的非选择性拒食率分别为25.7%、44.1%和26.8%。研究结果表明,DomainⅡ是拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。     

增效物质对核型多角体病毒AcMNPV的感染增效作用

由于昆虫病毒制剂与化学农药相比,其速效性较差,因而影响了其应用.因此,人们设想通过改造昆虫病毒来提高其杀虫效果,Merryweather将人工合成的蝎子毒素基因重组到苜宿尺蠖蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中去,建立了重组病毒AcMNPVAaIT.将该重组病毒接种于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫,结果该幼虫取食量显著减少,发育不良,死亡时间缩短[1].为了提高昆虫病毒的感染能力,人们研究了感染增效物质,如硼酸、卵磷脂、阳离子表面活性剂等均具有感染增效作用.近年来研究表明,某种荧光增白剂对数种昆虫病毒具有感染增效作用.本研究应用野生型AcMNPV-C6和基因重组AcMN-PVAaIT经口感染东方粘虫(Pseudaletia separata),并添加感染增效物质,研究基因重组病毒与野生型病毒对东方粘虫的杀虫效果,以及感染增效物质的增效作用.     

大菜粉蝶颗粒体病毒和菜粉蝶颗粒体病毒的形态学、血清学以及毒力的比较

电镜观察的结果表明,大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGV)和菜粉蝶颗粒体病毒(PrGV)的包涵体、病毒粒子和核衣壳在形态上相似。它们的包涵体在血清学上属同型,包涵体蛋白在电泳分析时均只能见到1条浓带。 PbGV和PvGV对菜粉蝶幼虫的致死中量接近,但幼虫对它们的剂量——死亡率反应有差异,在较高剂量时,PbGV引起的死亡率高于PrGV。PbGV对大菜粉蝶幼虫的毒性则比PrGV强得多。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

一个小麦csAtPR5-类似基因的克隆、鉴定和表达分析

 小麦(Triticum aestivumL.)品系‘兰考90(6)’在2AL染色体臂上携带1个隐性抗白粉病基因,暂命名为PmLK906。以‘中国春’/‘兰考90(6)21-12’杂交F₃代纯合株系构建的抗、感cDNA池为探针进行小麦基因芯片杂交,结果表明与粗山羊草(Aegilops tauschii)csAtPR5类似的基因在抗病池中的表达量比感病池中约高2^4.2倍。随后,从‘兰考90(6)21-12’中成功克隆了一个2 125 bp的全长csAtPR5-类似基因cDNA序列,暂命名为TaAetPR5(GenBank登录号:EU082094)。TaAet-PR5与csAtPR5的cDNA序列有93%的相同。TaAetPR5编码1个由657个氨基酸组成的多肽,与csAtPR5有88%的相同。蛋白推导分析表明TaAetPR5的分子量为74.5 kDa,pI 6.82,可能是一个可溶性的球蛋白,存在于细胞核中的可能性是95%。接种小麦白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)后12至72 h,‘兰考90(6)21-12’幼苗叶片中的TaAetPR5基因转录水平不断提高。感白粉病的‘中国春’中没有检测到TaAetPR5基因。     

Cloning, Sequencing and Expression of a Xylanase Gene from the Maize Pathogen Helminthosporium Turcicum

A gene encoding an endoxylanase from the phytopathogenic fungus Helminthosporium turcicum Pass. was cloned and sequenced. The entire nucleotide sequence of a 1991 bp genomic fragment containing an endoxylanase gene was determined. The xylanase gene of 795 bp, interrupted by two introns of 52 and 62 bp, encoded a protein of 227 amino acids showing up to 95% amino acid homology with other fungal xylanases. The precise splicing site of the introns was identified by sequencing the corresponding cDNA. A northern blot showed that the gene is expressed when the fungus is grown in a medium containing xylan as a sole carbon source. The cloned xylanase gene was expressed in maize plants during infection.     

酸碱度与紫外线对小菜蛾颗粒体病毒稳定性的影响

据报道,温度是影响小菜蛾颗粒体病毒(PlutellaxylostellaGranulosisVirus)稳定性的主要因素。PxGV在室温条件下可以较长时间保存,但在80℃高温条件下处理10分钟活性丧失较快[1]。日光辐射中的紫外线照射也是病毒失活的因素之一,在日光下4～60小时,小菜蛾颗粒体病毒致病力下降,如混以黑墨,防治效果有所提高[2]。土壤和叶片上的pH值对许多昆虫病毒活性具有一定的影响[3,4]。模拟紫外线和pH值对小菜蛾颗粒体病毒活性的影响,至今未有过报道。我们利用人工紫外线和不同pH值的溶液处理小菜蛾颗粒体病毒悬浮液,进一步以明确这两个因子对小菜蛾…     

丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达

丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan是粉虱类害虫的重要寄生性天敌昆虫,补充糖分等营养可以延长丽蚜小蜂寿命及增加其产卵量,但对其糖转运相关蛋白基因及其糖诱导表达尚不清楚。本研究克隆获得丽蚜小蜂的糖转运蛋白EfST1基因,与其他寄生蜂的糖转运蛋白基因序列同源性达65%以上;进一步采用实时荧光定量qPCR技术检测发现,饲喂不同浓度的葡萄糖溶液均可显著提高EfST1基因的表达量,且饲喂不同时间段（2～48 h）后,丽蚜小蜂EfST1基因表达量均显著高于对照组,2 h和48 h处理组间差异不显著。综上,EfST1基因可能与糖分补充及其转运密切相关,该基因诱导表达受糖分浓度影响小。研究结果为进一步研究寄生蜂生物防治过程中补充营养及其转运机制奠定基础。     

链霉菌769胆固醇氧化酶基因克隆、表达及生物学活性分析

胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,EC 1.1.3.6)是胆固醇降解代谢过程中的关键酶,在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛的应用价值。通过PCR方法从链霉菌Streptomyces ahygroscopicus 769的基因组中扩增得到769_ChOA基因(GenBank accession No. KF290994)。该基因全长为1578 bp,编码一个由525 aa组成的蛋白质,蛋白理论分子量为57 kDa,等电点为6.29。769_ChOA与来源于S. natalensis的胆固醇氧化酶基因的同源性为91%。构建了硫氧还蛋白－769_ChOA融合的表达载体pET32a::769_ChOA,以Escherichia coli Origami B(DE3)为表达宿主,获得了能可溶性表达的胆固醇氧化酶重组菌。经Ni亲和层析纯化得到的酶蛋白比活力为5.90 U/mg。酶学性质分析表明,该酶对胆固醇的催化活性最高,对测定的7种胆固醇类似物也都具有一定的催化能力。酶的最适温度和pH范围为20～40 ℃和pH 6.0～8.5,其活性均高于80%,且在30 ℃和pH 7.0时表现出最大的活性,酶活分别达到6.83和6.44 U/mg。酶在低于40 ℃和弱碱性条件下具有很好的稳定性。该酶对鳞翅目害虫亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)和水稻二化螟Chilo suppressalis(Walker)幼虫具有很强的杀虫活性,半致死浓度分别为27.4和17.1 mg/mL。     

棉花转甲基酶基因GhBSMT1的克隆、原核表达及表达谱分析

采用RT-PCR结合RACE技术从陆地棉中棉所12中克隆得到全长为1280 bp的苯甲酸/水杨酸羧基甲基转移酶基因序列,命名为GhBSMT1。预测该转移酶分子量40.8 kD,等电点6.12,为不稳定的亲水蛋白。通过原核表达获得大小约41 k D的可溶性重组目标蛋白。利用实时荧光定量PCR技术检测了棉花中GhBSMT1在植物激素处理和棉铃虫取食后表达转录情况,发现GhBSMT1在棉花的根、茎和叶中均有表达。水杨酸甲酯(Me SA)处理能够引起GhBSMT1下调表达,而茉莉酸甲酯(Me JA)处理对靶标基因影响不显著。另外,棉铃虫取食棉株6 h或48 h后,GhBSMT1表达量显著降低。结果表明,GhBSMT1在棉花各组织均有分布并受外源Me SA调控,该基因的表达还被棉铃虫取食抑制。     

芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表达

采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp,含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架,起始密码子位于211bp,终止密码子位于1998bp,共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的枯草芽孢杆菌几丁质酶核苷酸具有99.39%的同源性。将该基因与大肠杆菌-伯克氏菌穿梭质粒pRK415连接,获得重组质粒pRChi113。重组质粒电击转入伯克氏菌B418中,获得工程菌株B418-9、B418-13。与野生菌株B418相比,平板拮抗试验表明,工程菌株B418-9、B418-13对大丽花轮枝孢、立枯丝核菌、麦根腐长蠕孢、禾谷丝核菌抑菌效果明显提高。