基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。     

固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的比较

为对比固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的应用,选择猪血清345份、牛血清110份、羊血清159份,共614份血清样品同时进行O型和A型抗体检测,对比两种检测方法的符合率和对不同畜种的检出率。结果：两种检测方法在O型抗体检测中的符合率为95.3%,在A型抗体检测中的符合率为96.1%,对不同畜种的检出率无明显差异。结论：在大规模检测免疫抗体时,推荐采样固相竞争ELISA检测方法。     

口蹄疫O型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒的临床应用

用口蹄疫O型固相竞争ELISA检测血清1 150份,口蹄疫O型免疫血清820份,敏感性为91.83%;试剂盒特异性评价检测血清180份,其特异性为89.4%;固相竞争ELISA和液相阻断ELISA共同检测血清100份,其相关性分析为0.964 1,R2为0.929 5,属于高度相关。3批试剂盒检测血清样品50份,检测结果差异不显著,口蹄疫O型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒检测结果比较稳定,具有良好的批间可重复性和稳定性。     

固相阻断ELISA法检测口蹄疫病毒O型抗体的不确定度评定

目的：以口蹄疫病毒O型抗体(固相阻断ELISA法)检测的不确定度评定为例,以两种方法评定检测的不确定度。方法：分别使用“影响因素分析法”和“对照样品法”对检测口蹄疫病毒O型抗体的不确定度进行评定。结果：“影响因素分析法”的合成不确定度为0.1297,扩展不确定度为0.2593;“对照样品法”的合成不确定度为0.1040,扩展不确定度为0.2080。结论：对新方法进行不确定度评定时,“影响因素分析法”更适用,可帮助检测员更了解试验过程及注意事项,而“对照样品法”直接评估该试验过程的合成不确定度,减少大量计算过程,快速得出结论。     

口蹄疫病毒抗体SPC-ELISA定性检测与LPB-ELISA定量检测方法的比较

为评估固相竞争ELISA(SPC-ELISA)定性检测与液相阻断ELISA(LPB-ELISA)定量检测口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)抗体的符合度和一致性,以2022年春季从规模猪场、牛场、羊场采集的300份血液样本为试验对象,分别应用SPC-ELISA定性和LPB-ELISA定量检测方法进行O、A型FMDV抗体检测,对检测结果应用统计软件GraphPad Prism 8中的χ²检验进行差异显著性统计与分析,采用Kappa统计量分析两种ELISA检测方法的一致性。结果显示：SPC-ELISA检测两种抗体的阳性率总体均略高于LPBELISA,但差异不显著(P> 0.05)。两种方法检测O型FMDV抗体总符合率为94.81%,Kappa值为0.8;检测A型FMDV抗体总符合率为91.48%,Kappa值为0.7。结果表明,两种方法检测结果符合度高,且高度一致。因此,在FMDV抗体检测时可根据实际需要任意选择其中一种使用。本研究为技术人员在实际工作中科学选择检测方法提供了参考。     

口蹄疫病毒A型竞争ELISA抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

为评价口蹄疫病毒A型竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用前景,对2017年从福建省三明市采集的336份黄牛、奶牛、羊和猪血清样品,用A型cELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示,92份黄牛血清、92份羊血清、92份猪血清、60份奶牛血清的A型抗体阳性率分别为13.04%、11.96%、20.65%、86.67%。从上述4种血清中,各挑选10份血清(阴性、阳性各5份)共40份,采用口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体检测试剂盒进行验证。结果显示:cELISA检测为阳性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阳性19份;cELISA检测为阴性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阴性17份;两种方法的κ值为0.8,总符合率为90.00%。结果表明,A型cELISA试剂盒与LPB-ELISA试剂盒的符合率和一致性均较高,可用于口蹄疫流行病学调查和血清学监测。     

口蹄疫病毒特异性抗体间接ELISA检测方法的建立

以Chap10-VP1融合蛋白为包被抗原。建立了检测口蹄疫病毒特异性抗的间接ELISA方法。抗原包被浓度为50μg／L时。血清最佳稀释度为1：400，病毒与阳性血清的反应可被Chap10-VP1蛋白阻断，检测的灵敏度为1：1600。     

口蹄疫病毒抗体SA-ELISA快速检测方法的建立

旨在解决如何对现有方法进行优化创新以建立口蹄疫抗体检测新方法的问题,本研究在基于原有液相阻断ELISA的基础上进行方法优化,实现口蹄疫病毒抗体的快速、灵敏检测。本研究通过对抗口蹄疫IgG抗体标记生物素技术与HRP标记链霉亲和素(HRP-SA)相结合建立新的液相阻断ELISA检测方法(SA-LPBE),在猪,牛、羊血清样品中具有较高的符合率。结合实际情况,判定优化后牛、羊血清抗体效价≥128,猪血清效价≥64时,判定为阳性,与商用检测试剂盒结果一致。并且经符合率分析,与原试剂盒具有92.3%的符合率,其批内变异系数<5%,批间变异系数<10%。该方法改变了原有的需要制备兔抗豚鼠抗血清再标记HRP技术路线,根本上提高了酶促反应的效率,保证了方法原有敏感性的同时提高了方法的特异性;利用生物素标记抗体与HRP-SA反应迅速、标记原料稳定、检测背景值等优点实现了将液相阻断ELISA试剂盒操作时间由2 d缩短为3 h,解决了原有方法操作繁琐、用时过长、操作疲劳、不稳定、易出错等问题。建立的SA-LPBE可应用于FMDV抗体检测,为FMD流行和临床检测提供了技术方法。     

猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法的建立

根据猪口蹄疫O型流行毒株VP1序列设计出5条合成肽,以固相法合成并以此合成肽作为包被抗原建立猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法,并对该方法敏感性、特异性、重复性等进行验证。结果表明:该检测方法敏感性为96.0%,特异性为99.1%,批内与批间重复试验变异系数小于10.0%。比对试验结果显示,该检测方法与UBI猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒符合率为93.2%,与中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒符合率为85.7%。该猪口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法敏感性好、特异性强、稳定性高、操作简便,可用于检测O型口蹄疫抗体水平。     

口蹄疫病毒抗体检测

口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病,是由口蹄疫病毒引起的,常常发生在偶蹄动物,偶尔也见于人和其它动物。世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病,我国将其列为一类动物疫病。我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病,疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段,也可以根据免疫后的效果来制定合理免疫程序。本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测.以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,以纯化的目的蛋白包被,建立了间接...     

猪口蹄疫○型合成肽疫苗诱导的免疫抗体的监测

设3组猪群,首免和二免分别注射生理盐水1 mL、猪口蹄疫0型合成肽疫苗1 mL(说明书推荐免疫剂量)及猪口蹄疫0型合成肽疫苗3 mL(说明书推荐免疫剂量3倍量),二免28天后检测猪群的口蹄疫抗体,结果显示3组猪群的抗体合格率分别为33%、78%和100%,疫苗诱导的抗体水平达到农业部规定的动物强制免疫标准。     

口蹄疫病毒(FMDV)多重RT-PCR检测方法的建立

在大量比较国内外口蹄疫病毒（FMDV）流行毒株序列的基础上自行设计了检测FMDV通用型引物及FMDV AsiaⅠ型、O型口蹄疫病毒不同基因型即：中国型（Cathay）与泛亚株（PanAsia）的多重PCR引物。本试验确定了单项RT-PCR反应条件范围,在此基础上建立、优化了多重RT-PCR反应体系和反应条件,并进行了相关病毒检测试验。结果表明,本试验建立了有效、特异、敏感的检测FMDV AsiaⅠ型及O型FMDV不同基因型中国型与泛亚株的多重RT-PCR检测方法,为口蹄疫的诊断防制、流行病学调查及疫苗的使用奠定了基础。     

Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring the concentration of, and detection of antibodies to, Aujeszky's disease virus

A double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for measuring Aujeszky's disease virus (ADV) antigen concentration and an inhibition technique based on the former was developed for detection of antibodies to ADV. The results were checked by determining the cytopathic and serum neutralization titres. The correlation was satisfactory in both cases, with correlation coefficients above 0.8. When measuring ADV antigen concentration, the lower limit of detection was 10(3) TCID 50/0.2 ml. The sensitivity of ELISA in detecting antibodies to ADV was found to be superior to that of the serum neutralization test and, thus, enabled the testing of rabbit and guinea-pig sera.     

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物，用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD—P1中扩增得到目的基因VP1（639bp）。用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体．转化宿主菌BL21（DE3），经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆．测序证明目的基因正确插入了表达载体，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS—PAGE电泳，Westerll—blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高，表达产物的分子量约为41Ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34％。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。     

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus

An immuno-enzyme assay for measuring infectious bursal disease antibodies in chickens is described. The test is performed rapidly after coating plates overnight with partially purified antigen prepared in cell culture. Coated plates can be stored for at last 4 months. The chromatographically purified rabbit anti-chicken immunoglobulin-G, conjugated to horseradish peroxidase, was used optimally at a dilution of 1:3,000. It could be stored for at least 10 months without a reduction in titer. The test is safe, highly reproducible, specific, and sensitive. Results can be read visually or by spectrophotometry. Antibodies could be detected as early as 4 days postinfection. Serum titers rose rapidly to high levels, ranging from 1:1,600 to 1:25,600 by one week postinfection. High titers persisted for up to one year. The results of this assay compare favorably with results obtained with the agar-gel precipitin and virus-neutralization tests.     

口蹄疫病毒2C3AB基因的原核表达及ELISA方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)的2C蛋白中存在对自然感染和灭活疫苗免疫动物具有鉴别诊断意义的抗原表位。为建立一种敏感的血清学鉴别诊断方法,本研究截取FMDV 2C蛋白的C端B细胞表位较为富集的区域与全长3AB基因组合,经原核表达获得分子量约为44 ku的目的蛋白。Western blot分析表明,表达产物2C3AB与FMDV感染动物的阳性血清呈特异性反应。以纯化的目的蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,敏感性检测表明该方法比3ABC-ELISA具有更高的敏感性;同时检测猪圆环病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒标准阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复性试验显示,OD450nm值的变异系数小于9%。采用该方法检测不同背景的临床样品,并与3ABC-ELISA及进口试剂盒比较,总符合率分别为98.5%和90%。结果表明,该ELISA检测方法具有更高的敏感性和良好的特异性、重复性。     

Establishment and application of a solid-phase blocking ELISA method for detection of antibodies against classical swine fever virus

BackgroundClassical swine fever (CSF) is a severe infectious disease of pigs that causes significant economic losses to the swine industry.ObjectivesThis study developed a solid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay (spbELISA) method for the specific detection of antibodies against the CSF virus (CSFV) in porcine serum samples.MethodsA spbELISA method was developed based on the recombinant E2 expressed in Escherichia coli. The specificity of this established spbELISA method was evaluated using reference serum samples positive for antibodies against other common infectious diseases. The stability and sensitivity were evaluated using an accelerated thermostability test.ResultsThe spbELISA successfully detected the antibody levels in swine vaccinated with the C-strain of CSFV. In addition, the detection ability of spbELISA for CSFV antibodies was compared with that of other commercial ELISA kits and validated using an indirect immunofluorescence assay. The results suggested that the spbELISA provides an alternative, stable, and rapid serological detection method suitable for the large-scale screening of CSFV serum antibodies.ConclusionsThe spbELISA has practical applications in assessing the vaccination status of large pig herds.     

江门市规模化奶牛场2018—2019年O型、A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫免疫抗体监测结果分析

[目的]为了解江门市规模奶牛场口蹄疫免疫情况,有针对性开展防控。[方法]在2个规模奶牛场中随机监督采集奶牛血清进行检测,根据国标用ELISA法检测O型口蹄疫抗体,用液相阻断ELISA法检测A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫抗体。[结果]240份样品中O型、A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫抗体合格率依次为99.6%(239/240),92.9%(223/240),81.7%(196/240),差异显著(P<0.01);但A场2019年亚洲Ⅰ型合格率仅65.0%(39/60),未达农业农村部规定的70%标准,以及B场2018年亚洲Ⅰ型合格率仅71.7%(43/60);其他项目合格率均在80%以上。[结论]江门市规模奶牛场口蹄疫总体免疫效果较好,奶牛群能得到有效保护,但亚洲Ⅰ型合格率相对偏低,相应场应加强免疫和检测。