NPTⅡ基因和GUS基因在小麦遗传转化中的应用

对小麦遗传转化上常用的选择标记基因NPTⅡ的选择剂及GUS基因在幼胚愈伤组织中的转移进行了研究。结果表明用G418作为选择剂,浓度为20-30mg／L较为合适。幼胚愈伤组织与农杆菌共培养3d后,即可检测到GUS基因的瞬时表达。农杆菌LBA4404由500 mg／L羧卞青霉素抑制;EHA105、AGLI由500 mg／L头孢霉素抑制。而不能用卡那霉素。     

禾谷缢管蚜RpGST1基因的克隆、序列分析及原核表达

为揭示禾谷缢管蚜耐药性的分子机理,采用RT-PCR方法克隆了禾谷缢管蚜谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的cDNA序列,命名为RpGST1(GenBank登录号KP192850),并构建原核表达载体pET32-RpGST1,对RpGST1基因进行原核表达、SDS-PAGE和Western blotting检测。结果显示,禾谷缢管蚜RpGST1基因的编码区长651 bp,编码216个氨基酸,分子量约为24.06 kD,理论等电点为6.20;RpGST1基因在大肠杆菌中成功表达出一个分子量约为45 kD的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小一致。通过克隆RpGST1基因的cDNA序列并进行序列比对分析,表明构建了GST基因的原核表达载体并成功表达。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

以Taichung29为背景的小麦抗条锈病近等基因系转育进展

自1988年起,系统开展了以Taichung29为背景的小麦抗条锈病近等基因系转育及其基础性研究。采用回交法和系谱法相结合的转育方法,以春性品种Taichung29为轮回亲本作母本,分别与25个抗性供体即中国小麦条锈病菌鉴别寄主和国际上重要的抗条锈基因载体品种杂交、回交和自交。通过基因推导分析、单体分析和SSR标记技术检测目的基因,选育抗条锈近等基因系,现已获得重要进展,成功选育出8个以Taichung29为背景的抗条锈病单基因近等基因系,即Taichung29*6／Yr1、Taichung29*6／Yr2、Taichung29*6／Yr5、Taichung29*6／Yr7、Taichung29*6/Yr9、Taichung29*6／Yr10、Taichung29*6/YrSpP、Taichung29*6/YrKy2。另有9个组合转育获得343个抗性稳定株系,正检测其目的基因,3个组合转至BC₆F₃,自交纯合筛选抗性稳定株系,5个组合转至BC₅,继续回交转育。     

基于稻纵卷叶螟触角转录组的羧酸酯酶类气味降解基因CXE66鉴定及其表达谱

为了解稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味降解机制,利用稻纵卷叶螟基因组和触角转录组鉴定羧酸酯酶（carboxylesterase,CXE）基因,同时采用同源比对和系统发育进化树对其进行分类,进一步克隆获得稻纵卷叶螟CXE66的全长序列,并采用实时荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达情况。结果显示,共鉴定出触角特异性表达的45个CXE基因,其中新发现29个CXE,分属于CXE八个亚族。触角组织中高表达的CXE66基因开放阅读框长1 605 bp,编码534个氨基酸,且具有典型CXE结构特征,其在稻纵卷叶螟触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,且在触角中表达量最高。表明45个CXE基因可能参与稻纵卷叶螟的气味降解和性信息素降解、有毒物质代谢、蜕皮发育和神经发育等生理生化过程,其中CXE66可能参与酯类植物挥发物的降解。     

棉铃虫烟碱类乙酰胆碱受体α7亚基基因的鉴定及功能分析

为探究和挖掘更多杀虫剂靶标受体,采用PCR方法结合RACE技术克隆了棉铃虫烟碱类乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）的α7亚基（nAChR-α7）基因,通过荧光定量PCR技术进行时空表达分析,并采用电生理检测以及RNAi技术研究该基因对棉铃虫生长发育的调控作用。结果表明,棉铃虫nAChR-α7基因（GenBank登录号：KM884875）全长3 632 bp,包含编码496个氨基酸的1 491 bp开放阅读框。该基因具有nAChR典型结构,与其他鳞翅目昆虫nAChR-α7基因同源性较高,且包括胞外N端配体结合区、半胱氨酸环、Loop A~Loop F、跨膜区（TM1~TM4）和1个短的C端胞外尾。nAChR-α7基因在棉铃虫幼虫头部及成虫期高表达;通过将nAChR-α7基因在非洲爪蟾Xenopus oocytes卵母细胞中表达,并检测电生理信号,确定该基因是nAChR受体基因,但不能持续响应ACh信号。干扰试验结果显示nAChR-α7基因对棉铃虫幼虫生长发育无显著影响。推测该基因可能不是主要的nAChR基因,而是与其他亚基基因共同起作用。     

棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用

为明确N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m⁶A）修饰在棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV）侵染棉铃虫中的作用,根据基因组和转录组数据,对棉铃虫m⁶A结合蛋白基因YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）进行鉴定和分析,利用实时荧光定量PCR技术检测棉铃虫YTHDF1基因的时空表达模式、HearNPV处理后的表达变化情况以及RNA干扰效率,并调查该基因下调后对HearNPV复制及感染HearNPV棉铃虫死亡情况的影响。结果显示,棉铃虫YTHDF1基因开放阅读框全长为2 019 bp,编码672个氨基酸,含有1个保守的YTH结构域,其氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura同源物序列一致性达87.52%。YTHDF1基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在进入5龄期24 h幼虫中的表达量最高,在2龄取食期幼虫中的表达量最低。YTHDF1基因的空间表达谱呈现一定的组织特异性,在幼虫血细胞和成虫头部的表达量最高。HearNPV侵染棉铃虫后YTHDF1基因上调表达,经RNA干扰使该基因下调后显著抑制了HearNPV多角体蛋白基因polyhedrin的表达并延迟了感染HearNPV棉铃虫的死亡时间。表明YTHDF1基因在HearNPV侵染棉铃虫的过程中发挥着重要作用。     

棉铃虫羧酸酯酶基因HaCarE序列分析及其RNAi效应

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）编码基因的功能及其RNA干扰（RNA interfering,RNAi）效应,通过棉铃虫转录组数据筛选获得CarE基因,并克隆得到其全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（quantitative real-timePCR,qPCR）技术检测该基因在棉铃虫不同发育时期和不同组织中的表达水平,同时通过RNAi技术检测其对棉铃虫的致死效果。结果表明,从棉铃虫中克隆获得的HaCarE基因全长cDNA序列为1 677 bp,编码558个氨基酸,编码蛋白质由15个α螺旋和14个β折叠结构组成。qPCR检测结果显示该基因在棉铃虫不同发育时期均有表达,其中在1龄幼虫期的相对表达量最高,随着龄期的增长,相对表达量逐渐降低,在6龄幼虫期和蛹期的相对表达量最低;在5龄幼虫不同组织中,该基因在中肠中的相对表达量最高。注射dsHaCarE能够明显抑制靶标基因的表达,24 h抑制率为75.41%;饲喂dsHaCarE对棉铃虫2龄幼虫有显著致死作用,5 d时死亡率为64.57%,体长与对照组相比减少了23.29%。表明获得的HaCarE基因对棉铃虫生长发育有显著抑制作用,并有较好的致死效果。     

广聚萤叶甲雄虫生殖系统特异性精液蛋白基因的筛选及表达分析

为明确广聚萤叶甲Ophraella communa雄虫精液蛋白基因在性别间的表达差异并筛选出在雄虫生殖系统特异性表达的基因,从转录组及蛋白组数据库选取13个精液蛋白基因,采用实时荧光定量PCR技术检测其在广聚萤叶甲不同性别、组织及发育阶段的表达特征。结果显示,在广聚萤叶甲雄虫13个精液蛋白基因中,有9个精液蛋白的mRNA表达水平在雄虫中更高,有5个精液蛋白基因具有专一的雄虫生殖系统特异性,分别为PGK、sucA、ENO、SDH和PLA2b基因,在雄虫生殖系统中的表达量分别较其在头部的表达量高273.01倍、401.48倍、11.21倍、64.27倍和1.86倍。PGK、sucA和ENO基因均在广聚萤叶甲老熟蛹期急剧上调表达,在性成熟成虫中的表达量最高,分别是卵期表达量的43.48倍、31.03倍和11.89倍,三者具有明显的组织和发育阶段时空特异性,推测PGK、sucA和ENO基因参与广聚萤叶甲雄虫生殖的可能性较其余基因更高。     

花椒窄吉丁气味结合蛋白AzanOBP5的克隆与表达

为进一步明确花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白AzanOBP5在昆虫嗅觉识别过程中的功能,基于花椒窄吉丁转录组数据(SUB6796283)利用cDNA末端快速扩增技术对花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5进行全长克隆并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量检测技术测定基因AzanOBP5在成虫不同组织中的表达情况。结果显示,克隆获得基因AzanOBP5全长740bp(GenBank登录号为MT318834),5''端非编码区为172bp,3''端非编码区114bp,开放阅读框453bp,编码150个氨基酸。序列分析表明,AzanOBP5氨基酸序列与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP5的氨基酸序列一致性最高。成功构建pET-21a-AzanOBP5重组质粒并在大肠杆菌Escherichia coli中表达,经过诱导和纯化条件的优化及Western blot鉴定,得到的融合蛋白His-AzanOBP5大小符合预期。基因AzanOBP5在雌雄成虫的不同组织中均有表达,其中在成虫腹部的表达量最高。表明花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5除参与嗅觉识别过程外,还可能具有其他生理功能。     

Approaches to pathogen-mediated resistance breeding against plum pox potyvirus in stone-fruit trees1

In a programme for developing systems which allow the transfer of foreign genes into apricot cultivars, we have tested cotyledons of immature embryos, somatic embryos and leaf discs. Apricot plants have been transformed, and then regenerated, with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing various binary plasmids: pBinGUSint, carrying the marker gene β-glucuronidase (GUS), and pBinPPVm, carrying the coat-protein gene of plum pox potyvirus (PPV). The marker gene GUS was used for visual evaluation of the efficiency of the transformation system. The coat-protein gene was used in the hope of introducing coat protein-mediated resistance to one of the most important stone-fruit pathogens in Europe and the Mediterranean area.     

编码harpin_（Xoo）蛋白的基因hpa1_（Xoo）转化菊花增强对蚜虫的抗性

将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpa1Xoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpa1Xoo-bar,由根癌农杆菌Agrobacterium tumefa-ciensLBA4404介导,叶盘法转化寒菊QX-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系。经PCR、Southernblot和RT-PCR检测证明hpa1Xoo已整合到寒菊基因组中。在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜Myzus persicae的繁殖（t〈0.01）。RT-PCR表明转基因植株中hpa1Xoo能够在转录水平正常表达。hpa1Xoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性。     

dsRNA分解酶PAC 1对4种植物病毒、3种类病毒dsRNA的降解活性检测及转pac 1基因烟草的获得

 将来自粟酒裂殖酵母的pac 1基因,导入原核表达载体pET-5a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,其表达产物能够降解4种植物病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、Tobacco mosaic virus(TMV)、Rice black-streaked dwarf(RBSDV)和Rice dwarf virus(RDV)和3种类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)、Coleus blumei viroid(CBVd)和Hopstunt viroid(HSVd)的dsRNA。将pac 1导入双元载体pBI121,并转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草(品种NC89)组培苗的叶片为受体材料进行转化,经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养,获得了50株Kan抗性植株,收获T₁种子分别播种,对这些转基因植株进行分子生物学检测。PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测结果表明,pac 1基因已整合到受体基因组中。     

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。     

含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的构建

 本研究用来自烟草的具有高度病原物特异性的两个诱导启动子EAS4和hsr203J,串联驱动GUS基因的表达,同时考虑到转基因植物的安全性,引入双边界序列,构建了含双病原物诱导启动子的植物安全表达载体。将表达载体转化烟草获得转基因植株。分析显示,在正常生长情况下转基因烟草检测不到GUS活性,或活性极低;而受疫霉激发子parasiticein、Phytophthora nicotianea[0]的孢子悬浮液和Ralstonia solanacarum的菌悬液诱导后,转基因烟草叶片中可检测到明显的GUS活性。结果表明,构建的植物表达载体所含双病原物诱导启动子均具有良好的诱导活性,可用于植物遗传转化。     

串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性

 在植物抗病基因工程中,目标基因可控的高效表达是一重要目标。在前期的研究中,我们将串联的病原物高度特异性诱导启动子EAS4(EP)和hsr203J(HP)转入烟草,uidA基因在相应病原物或激发子诱导后可被驱动表达。为进一步研究此串联双启动子驱动的基因表达特性,采用荧光法对GUS诱导表达活性进行了定量检测。结果发现,双启动子表现较高的诱导表达活性,双启动子与单启动子的活性差异均达极显著水平。研究还发现,两个启动子串联的顺序对其活性强度和时间动态有影响,双启动子HP+EP的诱导表达高峰出现在诱导后6~10 h,而EP+HP的活性高峰出现在诱导后8~14 h。同时,初步分析了串联的EP和HP协同促进基因高水平表达的原因。串联的双病原物特异性诱导启动子不但可响应较广谱的病原物的诱导表达,而且可协同促进基因的高效表达,因而在植物抗病基因工程中具有广阔的应用前景。     

转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究

 用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。