五指山小型猪近交系培育与遗传资源创新

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所二十多年来,利用2头五指山小型猪(Sus scrofa)(Wuzhishan mini-pig,WZSP),采用近交繁育,培育出近交系,最高已获得近交F22,并进行开发应用。对WZSP近交系全基因组测序并与人(Homo sapiens)、短尾猴(Macaque mulatta)和大鼠(Rattus norvegicus)比对,初步分析发现,该近交系全基因组具有较高的纯合度和特异的分子遗传特征,不仅证明了我国实现遗传资源创新培育近交系的可靠性,而且证明该近交系猪是人类理想的"替难者"。实现我国小型猪遗传资源创新的培育目标,取得了一定的经济和较大社会效益,有着重要的现实和历史意义。     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

中国实验用小型猪种质资源中心

我国拥有独特而又丰富的小型猪资源,如:五指山小型猪、广西巴马小型猪和贵州小型猪等具有体型小、遗传稳定、耐近交、耐粗饲等特点。小型猪在解剖学、生理学、疾病发生机理等方面与人类有较大的相似性,作为     

五指山猪GH、IGFBP3基因SNPs检测及与生长性状的关联分析

以五指山猪为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合技术,对GH基因和IGFBP3基因进行多态性检测,并分析其与生长性状（体质量,体高,体长和胸围）的相关性。结果表明,GH基因第2外显子存在一处G→A转换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,BB基因型的体重显著高于AA基因型和AB基因型;IGFBP3基因第2外显子存在一处G→C颠换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型的体高显著高于BB基因型;IGFBP3基因第4内含子存在一处碱基C缺失,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型体重显著高于AB基因型和BB基因型。研究将为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面研究提供了遗传学依据。     

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

编者按

我国是世界第一养猪大国和猪肉消费大国,并且猪肉需求量不断增长,肉质要求不断提高。但我国优良种猪长期依赖进口,猪品种培育工作任重道远。我国有世界1/3的猪种,其中太湖猪等以高产仔数闻名,通城猪等以肉质嫩美著称,五指山猪等小型猪特色鲜明。     

电转染法电压优化与广西巴马小型猪转基因克隆胚胎的生产

本试验旨在优化电转染电压并构建转基因体细胞,为生产转基因广西巴马小型猪打下技术储备。以新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞和pEGFP-N1为材料、以细胞存活率和转染率为电转染效率评价指标,筛选最佳电压,然后用优化电压进行电转染并经G418抗性筛选获得转基因体细胞系,通过体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎。本研究筛选出最佳电压为120 V,用优化电压进行电转染并成功构建表达GFP的转基因细胞,最后通过体细胞核移植成功获得表达GFP的转基因克隆胚胎。结果表明优化的电转染电压可以高效构建广西巴马小型猪转基因体细胞,并可通过体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。     

利用大白猪×民猪F2资源群体开展瘦肉量全基因组关联研究

高密度单核苷酸多态性(SNP)芯片的出现和基因分型技术平台的发展使在猪上开展全基因组关联分析(GWAS)研究成为现实。本研究以大白猪(Sus scrofa)×民猪(S.scrofa)F2设计资源群体为研究对象,采用Illumina公司猪SNP60K分型芯片技术,开展胴体瘦肉量(LMW)GWAS研究,寻找与瘦肉量相关的遗传变异。所有F2代个体在达到(240±7)d日龄时进行屠宰测定。对分型后的355头F2个体,采用基于混合模型及回归的快速全基因组关联及基因组控制法(GRAMMAR-GC)方法进行GWAS分析,结果获得14个在染色体水平与瘦肉量性状显著关联的SNP位点(P<9.63e-06,SSC1;P<2.37e-05,SSC2;P<1.56e-05,SSC14)。其中2个SNP位点ALGA0010777和ALGA0010788分别位于1号染色体上285030256和285276856bp处;10个SNP位点都位于猪2号染色体末端,可能与已发现的瘦肉量基因突变位点IGF2-intron3-G3072A紧密连锁;2个SNP位点ASGA0065444和ASGA0065455位于14号染色体上99627980和100078535bp处。本研究为猪的瘦肉量性状提供了显著关联SNP位点,预测了新的候选基因。初步阐释了中外猪种瘦肉量性状巨大差异的分子机制,为进一步开展分子育种工作提供了基础研究资料。     

表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应.     

上海白猪(上系)遗传多样性和群体结构分析

上海白猪(上系)(Sus scrofa)是上海市闵行区的地方培育品种,近年来,由于引进品种的冲击,其各项生产指标严重衰退,且对其种质特性、遗传基础和杂交性能等缺乏应有的了解.本研究应用全基因组范围内的遗传标记,对上海白猪(上系)群体进行了遗传多样性和群体结构的分析.首先对反映群体内遗传多样性的3个重要指标-等位基因的丰度(allelic richness,AR)、标记多态性的比例(proportion of polymorphic markers,PN)和期望杂合度(expected heterozygosity,He)进行了分析和计算.结果表明,上海白猪(上系)与太湖和西方猪种对比,其遗传多样性最高(PN=0.731,AR=1.709,He=0.221).上海白猪(上系)与太湖品种之间的遗传分化程度(0.237±0.007)大于其与西方品种之间的遗传分化程度(0.219±0.008).另外,用主成分分析(principal components analysis,PCA)、STRUCTURE和系统进化树等对群体结构进行了分析.结果显示,上海白猪(上系)群体内的遗传多样性比太湖猪种和西方猪种高;群体间遗传距离显示上海白猪(上系)相对于太湖猪种更接近西方猪种;主成分分析、聚类分析与群体结构分析皆显示上海白猪(上系)能够形成独立的分组.以上结果表明,从分子水平上看,将上海白猪(上系)作为一个独立的培育品种是合理的,特别是其具有独特的遗传结构,应进一步加强其保护、开发和利用.     

猪耳廓软骨板细胞的体外传代培养

耳廓是哺乳动物听觉器官的重要组成部分.猪(Sus Scrofa)耳廓大小经历长期的人工驯养和选育后变异很大.目前,对猪耳廓大小的研究主要集中在遗传机理的解析,对其在细胞水平的研究还尚未完善.本研究通过酶法分离得到猪耳廓软骨板细胞并在体外培养,将原代猪耳廓细胞连续培养,用流式细胞仪分别检测从3～10代耳廓软骨板细胞的大小和分布情况,以及耳廓软骨板细胞与软骨干细胞阳性标记物CD44和CD90的结合能力.同时,将3～10代细胞分别与Annexin V-FITC/PI(细胞凋亡试剂盒)孵育,用流式细胞仪进行凋亡特性分析.通过流式细胞检测发现,体外培养的软骨板细胞由软骨细胞(P1)和软骨前体细胞(P2)组成.P1细胞占大多数(69.4％),呈纤维状;P2细胞为少数(11.0％),呈椭圆状.与CD44和CD90结合分析表明,P1细胞几乎不能与CD44结合,绝大部分P2细胞能与CD44结合,P1和P2细胞均能与CD90相结合,P2细胞结合能力略强于P1细胞.分别对两类细胞进行细胞凋亡分析后发现,P1细胞体外培养只有少量细胞凋亡或坏死,活细胞率达(96.61±1.32)％,说明P1细胞在体外传代过程中能维持稳定状态;P2细胞处于晚期凋亡和坏死细胞的比例＞83％,说明P2细胞在体外培养条件下细胞状态不稳定.本研究结果表明,体外建立一套针对于软骨前体细胞培养的体系很有必要,以保证软骨前体细胞可以持续增殖、并可向软骨细胞转化.本研究为今后以猪耳廓作为模型开展人类弹性软骨再生医学研究提供了基础依据.     

唾液腺特异表达植酸酶转基因猪的制备及分析

猪(Sus scrofa)对饲料中植酸磷的消化利用效率很低,其粪便中排放大量未吸收的磷,对环境产生严重污染,在猪唾液腺中表达分泌植酸酶是解决猪粪磷污染的一条新途径.为了制备唾液腺特异表达植酸酶的新型减磷排放转基因猪,本研究构建了一条由猪腮腺分泌蛋白基因(parotid secretory protein,PSP)启动细菌源植酸酶基因appA(acid phosphoanhydride phosphohydrolase)表达的转基因载体,并利用体细胞核移植技术获得14头原代(F0)转基因克隆猪,经PCR鉴定,其中8头为阳性猪.PCR分析显示,appA基因在转基因猪的唾液腺组织特异表达,但在肾脏、肝脏、心脏、十二指肠等组织中不表达.营养代谢分析证明,转基因猪粪磷排放量比非转基因猪显著减少了16％(P＜0.05),而转基因猪对干物质和能量的表观消化率以及对Ca、P的消化率均高于野生型猪,但未达到显著水平.外源基因从F0转基因猪稳定遗传至F1,并且Southern blot分析显示,外源基因是以单拷贝形式整合至转基因猪基因组.F1转基因猪的appA表达模式与F0转基因猪相似,其只在唾液腺中特异表达,且以颌下腺表达最高,其次是腮腺和舌下腺,在肾脏、心脏、肝脏等组织不表达.本研究成功获得唾液腺特异表达植酸酶转基因猪,为培育新型减磷排放的环保转基因猪新品种提供了科学依据.     

Development of a microsatellite-based method for the differentiation of European wild boar (Sus scrofa scrofa) from domestic pig breeds (Sus scrofa domestica) in food

Twenty microsatellites (simple sequence repeats, SSR) were used to discriminate wild boar from domestic pig and to identify mixtures of the two. Reference groups of wild boar and pig samples were collected from the UK and Europe for genetic assignment tests. Bayesian Analysis of Populations software (BAPs) gave 100% correct assignment for blind wild boar and pig samples and correctly identified mixed samples. DNA was extracted from 12 commercial food samples (11 labeled as containing wild boar) including patés, salamis, and sausage, and good SSR profiles were obtained. Eleven samples were correctly assigned as pig, and two as mixed meats. One sample sold as wild boar meat was clearly assigned as pig. A further 10 blind samples of meat cuts were analyzed, eight wild boar and two pig, and all were correctly assigned.     

猪成熟脂肪细胞分离培养及去分化研究

成熟脂肪去分化技术可为研究脂肪细胞分化提供均一的前体脂肪细胞。本研究分离培养了猪成熟脂肪细胞,并去分化为前体脂肪细胞。本实验采用Ⅱ胶原酶消化后离心分离1~3日龄仔猪(Susscrofa)皮下脂肪组织,天花板法培养获得成熟脂肪细胞。显微镜下观察脂肪细胞去分化形态学变化,并在成脂诱导培养液的作用下诱导再分化。采用油红O染色法检测分化不同时期细胞脂滴聚集效率,脂滴的累积随诱导的进行不断增加。RT-PCR检测成熟脂肪细胞标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARγ)和和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的mRNA相对表达量,分化早期基因表达水平较低,其表达水平在分化过程中持续增高,在分化后期PPARγ相对表达量与诱导分化前增加了2.8倍,FABP4增加了约62倍(差异显著P<0.05)。说明去分化获得的前体脂肪细胞在成脂诱导培养液作用下,可有效地分化为成熟脂肪细胞。本研究优化了猪成熟脂肪细胞分离和培养体系,并通过去分化获得具有再分化能力的前体脂肪细胞,为进一步深入研究猪脂肪细胞分化与代谢提供技术平台。     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

Effects of Feral Pig (Sus scrofa) Exclusion on Enterococci in Runoff from the Forested Headwaters of a Hawaiian Watershed

Water, Air, &; Soil Pollution - The role feral pigs (Sus scrofa) as a source of fecal contamination in Pacific Island ecosystems is not well understood. This study investigated the effects of...