超表达细胞周期蛋白A2基因(CycA2)抑制猪卵母细胞PB1体外排出

在卵母细胞成熟过程中,细胞周期蛋白A2(CyclinA2,CycA2)可与不同周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK)相互作用,通过其周期性表达和降解,参与调控细胞周期.为探讨CycA2基因对猪(Sus scrofa)卵母细胞体外成熟的影响,本研究从猪卵巢中克隆CycA2基因,构建野生型pVenus-CycA2和非降解型pVenus-DN157CycA2真核表达载体,转染至hela细胞,确认重组质粒的表达及定位情况.将pVenus-CycA2、pVenus-DN157CycA2体外转录为cRNA,对猪卵母细胞进行显微注射后,体外成熟培养一段时间后统计第一极体排出率,并观察其表达和定位.结果显示,显微注射了pVenus-CycA2、pVenusDN 157CycA2cRNA的卵母细胞,其第一极体(first polar body,PBl)的排出率与对照组相比极其显著降低(P＜0.001,);用Roscovitine处理的pVenus-DN 157CycA2表达的卵可恢复排出PB1的能力,其PB1排出率与对照组相比差异不显著.本研究首次揭示了CycA2基因对猪卵母细胞体外成熟过程的影响,为探索CycA2参与染色体分离调控的分子机制提供理论依据,同时也为进一步研究第二次减数分裂过程中CycA2基因的作用提供了一个平台.     

牛p53基因真核表达载体构建及其在卵母细胞中表达定位

p53是一种肿瘤抑制基因,在细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老和自噬过程中发挥着调控作用,在机体的各个组织中广泛表达.本研究旨在构建牛p53基因真核表达载体并研究其在牛卵母细胞中的表达和定位.首先从牛(Bos taurus)卵丘细胞中克隆了p53基因并将其连接到pMD 19-T载体上,双酶切鉴定后定向连接到pVenus载体上构建了pVenus-p53真核表达载体,经脂质体2000介导转染Hela细胞,确定重组质粒在Hela细胞中的表达定位,主要定位于细胞核.然后用体外转录试剂盒将p53-Venus转录成cRNA,通过显微注射观察其在卵母细胞中的表达定位情况,主要定位于细胞核,但胞质中也有少量表达.最后,取体外培养不同时期的牛卵母细胞,通过实时定量PCR检测p53在体外培养不同时期的表达量的变化,采用2-ΔΔC法分析p53/β-actin表达水平的变化值,p53的表达从GV期到MⅠ期迅速升高,在MⅠ期其表达量达到最高,随后又逐渐降低.本研究构建了牛p53真核表达载体pVenus-P53,并且体外转录的p53-Venus cRNA能在牛卵母细胞中正确表达定位,检测了p53在牛卵母细胞成熟培养各个时期表达量的变化,为进一步研究p53在牛卵母细胞体外成熟中的作用提供了参考资料.     

小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2磷酸化的变化

通过Western杂交检测了小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2的磷酸化变化情况。用抗p34^cdc2C末端抗体的杂交结果显示，小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2表现为上、中、下三条带，其中中带在培养4h出现，并持续增加直到培养16h,在20h有一个下降趋势并在培养24h又回升；上带从0－16h表现为持续下降趋势，20h稍回升后24h又下降；下带在整个培养过程中表现平稳。用特异性识别p34^cdc2去磷酸化的Tyr-15和Thr-14的抗p34^cdc2N末端抗体杂交结果，证明中带为p34^cdc2在Tyr-15和Thr-14上去磷酸化的形式。     

UTX与JMJD3体外转录载体构建及其在小鼠卵母细胞上的验证

UTX(ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat X chromosome)和JMJD3(jumonji domain containing 3)是组蛋白H3赖氨酸27位三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation,H3K27me3)去甲基化酶,可以调控动物机体生长、肌肉发育、调节代谢等重要生理功能.本研究根据小鼠(Mus musculus)UTX和JMJD3 mRNA序列设计3对引物,分别构建了体外转录载体pMD19T-T7UTX和pMD19T-T7JMJD3.分别将体外转录mRNA注射进小鼠卵母细胞,并利用免疫荧光方法对H3K27me3进行检测.转录产物经电泳检测,结果显示,UTX与JMJD3条带清晰与预期大小相符;通过显微注射mRNA的卵母细胞,其H3K27三甲基化修饰明显减少.本研究成功构建了UTX与JMJD3体外转录载体,并在细胞水平证明转录产物能够翻译出具有活性的酶,为利用此载体研究UTX与JMJD3在生长发育及相关疾病发生中的机制提供基础资料.     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

利用锌指核酸酶(ZFN)技术介导敲除猪卵母细胞孤雌胚胎中肌肉生长抑制素基因(MSTN)的初步研究

肌肉生长抑制素基因(myostatin,MSTN)是转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)超家族的一员,具有特异性调控动物肌肉生长的功能。为证明锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)修饰技术在猪(Sus scrofa)胚胎水平上对MSTN基因修饰的效率,筛选高效的作用靶点,本研究通过构建针对MSTN基因特异位点的ZFN质粒,采用显微注射方法,将其注射进入猪卵母细胞孤雌胚胎细胞,采用PCR对培养后的囊胚进行MSTN基因的扩增检测,并对其进行序列测定比较分析。研究结果表明,373枚注射囊胚基因组经MSTN引物特异性扩增并测序,检测到2枚发生突变,均在ZFN靶位点处,第39号囊胚发生14个碱基的单碱基突变,第321号囊胚发生11个碱基的单碱基突变,ZFN介导的打靶效率为0.54%。本研究进一步验证了ZFN基因编辑技术在敲除猪MSTN基因上应用的可行性,为MSTN基因敲除猪的制备提供了依据。     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

甘蔗富含甘氨酸蛋白基因(Sc-GRP)的克隆及其表达分析

本研究在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,通过EST (expressedsequence tag)序列测定和生物信息学分析,获得了1个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-GRP.生物信息学分析表明,该基因全长518bp,包含一个273bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),5'端非编码区(untranslated region,UTR)长58bp,3’端UTR长187bp,且在3’端UTR中有典型的加尾信号AATAAA和polyA结构.该基因编码长度为90个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10.12kD,等电点为5.86.Sc-GRP中甘氨酸含量最高,达到13％,且包含明显的GGX和GX重复结构单元.Sc-GRP没有信号肽和RNA结合位点.定量PCR分析结果表明,该基因在成熟叶片中的表达量远高于其在心叶中的表达量.在甘蔗茎中,随着节间成熟度的增加,其表达量逐渐升高,但在成熟根中几乎没有表达.在铝盐胁迫下,该基因在甘蔗初生根中的表达先是升高,然后随胁迫时间的增加而下降.研究结果提示该基因定位于细胞质,参与细胞的渗透调节,本研究结果为该基因的功能解析及其在甘蔗分子育种上的应用积累了基础资料.     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

小鼠卵母细胞去核方法的改进

为摸索一种简单有效的小鼠(Mus musculus)卵母细胞去核方法,本研究对压电脉冲装置(Piezo)辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞去核方法进行了改进,比较了改进的去核方法和常规去核方法,在无蔗糖或含蔗糖去核操作液中的去核效果及核移植重构胚的后续发育能力;用改进的去核法在无蔗糖的去核操作液中对卵母细胞进行去核,比较卵母细胞去核操作液及核移植操作液中添加不同浓度胎牛血清(FBS)时核移植重构胚的后续发育能力。结果显示,MⅡ期卵母细胞在无蔗糖和含3%蔗糖的去核操作液中通过调整显微镜物镜距离显示MⅡ期纺锤体区域的方法进行显核,显核率分别为98.4%(184/187)和98.7%(153/155)(P0.05)。在无蔗糖或含蔗糖的去核操作液中,用改进的去核法,即去核针穿过透明带后,紧贴MⅡ期纺锤体区域的质膜,施加负压将MⅡ期纺锤体区域吸住并将其直接拉出卵母细胞,去核率分别为84.6%和88.2%;用常规去核法在这2种去核操作液中去核,去核率分别为83.1%和88.6%,各组之间差异均不显著(P0.05);用改进的去核法比常规去核法吸出的胞质少。用改进的去核方法在无蔗糖的去核操作液中去核后,构建的核移植重构胚发育到8-细胞、桑椹胚和囊胚的比率最高,桑椹胚发育率(16.3%)和囊胚发育率(5.8%)显著高于用该法在含蔗糖的去核操作液中去核组(5.1%和0)。用常规去核法在无蔗糖操作液及含蔗糖操作液中去核后,核移植重构胚的桑椹胚发育率分别为3.3%和1.2%(P0.05),且均未获得囊胚发育。去核操作液和核移植操作液中添加20%FBS时,重构胚囊胚发育率显著高于添加10%FBS组(10.9%对4.9%)(P0.05),表明用改进的去核方法在添加20%胎牛血清(FBS)的操作液中进行去核及核移植操作是可行的,而且对重构胚后续发育的支持能力较好。本研究为进一步提高小鼠体细胞核移植效率做出了有益的探索。     

小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响

本实验通过牛生发泡(GV)期无卵丘细胞卵母细胞-裸卵(denuded oocytes,DOs)与小鼠卵丘细胞(mouse cumulus cells,mCCs)共培养,研究异种mCCs对牛DOs体外成熟和孤雌激活后发育的影响,进而探讨卵丘细胞对卵母细胞的作用机制,为牛卵母细胞体外成熟效率提高提供实验依据.牛卵母细胞分为COCs(cumulus-oocytes complexes)组、DOs+bCCs(bovine cumulus cells,bCCs)组、DOs+mCCs组和DOs组4个组合,体外成熟22～24h后,检测各组卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卯母细胞中谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量利孤雌激活后的发育能力,以及卵母细胞内骨形态发生蛋白15( BMP15和生长分化因子9(GDF9)mRNA相对表达水平.结果表明:(1) DOs+mCCs组和DOs+bCCs组卵母细胞核成熟率[(68.48±5.71)％,(71.00±4.27)％]显著低于COCs组(84.70±3.41)％(P＜0.05),但均显著高丁DOs组(54.26±5.03)％(P＜0.05); (2) DOs+mCCs组MⅡ卵母细胞GSH含量和孤雌激活囊胚率[(2.48±0.24) pmol/oocyte,(44.19±4.03)％]与DOs+bCCs组[(2.49±0.18)pmol/oocyte,(48.57±5.20)％]和DOs组[(2.40±0.17)pmol/oocyte,(43.47±7.34)％]之间没有差异,但分别显著低于COCs组[(9.67 ±0.18)pmol/oocyte,(59.93±6.13)％](P＜0.05),各组孤雌激活卵裂率之间没有显著差异[(98.85±4.32)％,(92.11±2.00)％,(95.40±4.11)％,(93.18±3.19)％](P＞0.05);(3)DOs+mCCs组、DOs+bCCs组和COCs组卵母细胞中BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平均显著性高于DOs组(P＜0.05),其中,DOs+mCCs组和COCs组GDF9 mRNA相对表达水平显著高于DOs+bCCs组(P＜0.05).实验结果表明,mCCs能提高牛DOs的核成熟率及BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平,但对牛DOs的细胞质成熟和MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育没有促进作用,说明卵丘细胞通过一些旁分泌因子促进卵母细胞核成熟,且这些因子的作用可能没有种属特异性.     

母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中的功能

P小体是一种存在于真核细胞质的蛋白颗粒,由多种酶组成并参与mRNA调控.应激颗粒是P小体的一种类似颗粒,是一种在应激情况下形成并由蛋白和RNAs组成的致密集合体,应激颗粒能够暂时性存储mRNA.这两种颗粒在基因转录后调控起重要作用.卵母细胞的成熟是一个持续时间长且复杂的过程.小鼠(Mus musculus)卵母细胞的成熟过程存在转录静默的现象,即小鼠卵母细胞从减数分裂阻滞期(germinal vesicle,GV)到二细胞期不进行任何转录活动.然而,小鼠卵母细胞成熟过程需要大量蛋白的参与.在这一成熟过程中,新合成的蛋白只来源于母源mRNA为模板翻译形成的产物.因此,小鼠卵母细胞对母源mRNA的精确调控在小鼠卵母细胞成熟进程中显得尤为重要.母源mRNA被认为存储于一种类似P小体的信使核苷酸蛋白复合物颗粒里面,本文将这种蛋白复合体称之为母源P小体.本综述对P小体及其功能进行概述,在此基础上着重讨论小鼠卵母细胞内母源P小体在小鼠卵母细胞成熟过程中对母源mRNA的调控作用,提出了母源P小体在小鼠卵母细胞成熟调控中发挥作用的可能机制,并提出卵母细胞是一个新颖的研究mRNA转录后调控的模型.     

小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育

分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据.     

小鼠生后不同发育阶段睾丸组织中Crumbs-3(Crb3)的表达

为确定极性调控蛋白Crumbs-3(Crb3)在小鼠(Mus musculus)睾丸组织的定位及其在曲精小管精子发生及间质细胞发育过程中的分布规律,本研究运用常规石蜡切片-HE染色方法和免疫荧光组织化学技术,分别对小鼠生后不同发育阶段睾丸组织结构及Crb3在不同发育时期睾丸组织中的分布进行了研究。结果显示,随着个体发育,曲精小管的直径及生精上皮的厚度不断增大,管腔则由小增大、变小再增大;睾丸曲精小管内生精细胞处于动态的发育变化中,2周龄的生精小管内仅有增殖分裂的数层精原细胞和支持细胞,4周龄时出现各级生精细胞、但无精子形成;之后,继续增殖分裂,至8周管腔内有大量精子形成;并随日龄增加生精细胞密度不断加大;支持细胞的形态随着个体发育逐渐变得清晰而易于辨认;间质细胞则随个体发育体积不断增大、核质比例逐渐下降,而胞质嗜酸性逐渐增强。免疫荧光染色结果显示,Crb3蛋白主要分布在各周龄睾丸曲精小管生精细胞胞膜以及睾丸间质细胞胞膜,且间质细胞上的阳性信号明显强于生精细胞。研究结果提示,Crb3不仅与生精上皮细胞的极性建立和维持有关,而且可能参与睾丸类固醇激素的合成和分泌。     

卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。