砀山酥梨细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450在植物的苯丙烷类、生物碱和萜类等生物合成中起着非常重要的作用。为了更好地了解砀山酥梨中P450的种类和数量,利用砀山酥梨基因组的氨基酸和c DNA数据库对P450基因进行筛选,分析砀山酥梨全基因组中P450基因的种类、进化关系、基因的物理定位、以及二级结构元件。结果显示,在砀山酥梨基因组中发现并初步确定了226个P450基因,通过基因的定位分析确定了226个基因分布在17条染色体上,其中除了4、5、9号染色体上无基因簇分布外,其他的染色体都有基因簇的分布。通过基因结构和进化树之间的比较,进一步确定了基因结构和进化之间的相互联系。二级结构的分析表明,砀山酥梨P450蛋白序列同样具有P450蛋白特征性结构域。本研究结果为砀山酥梨P450基因功能的深入分析奠定了基础。     

洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用,是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其他植物的CPR基因设计简并引物,并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段,然后通过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明,克隆得到洋甘菊的CPR基因,提交至GenBank,得到登录号KJ004519,其cDNA全长2 272 bp,包含2 106 bp的编码区,翻译701个氨基酸序列;生物信息学分析表明,洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近,CPR基因氨基酸序列有94%的相似性,CPR蛋白质结构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)结构域;通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量,结果表明,CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高,是叶中表达量的20多倍,在舌状花冠和茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因,CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关键酶,为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础资料。     

生物细胞色素P450的研究进展

简要介绍了生物细胞色素P450分布的多样性、P450的功能、P450在不同领域的研究现状与进展。鉴于P450的研究无论在理论上探索生物的生理代谢、选择进化和 生物与环境的关系方面，或在环境保护、农业生态、生物防治、作物基础工程和医药卫生等应用方面，都有广泛的实践意义，因此，应该受到更大的关注和重视。     

油菜叶片衰老相关基因的分离细胞色素P450 cDNA的克隆和序列分析

通过绿叶和衰老叶片cDNA的缩减杂交和差别筛选,富集并分离了缩减cDNA文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段.以目的基因片段为探针,通过筛选油菜衰老叶片的cDNA文库,分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长cDNA LSC46.DNA序列分析结果表明,LSC46可读框架全长由1509个碱基组成,可以编码503个氨基酸残基,它的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与拟南芥菜依赖于单加氧酶的细胞色素P450的相应序列相比,分别有84.23%和83.50%的同源性.     

小鼠卵巢内细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶的发生

利用免疫组织化学技术探讨了细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶[P450（SCC）]在小鼠卵巢内的发生时相，研究发现15日龄的胎鼠卵巢内即存在P450（SCC）的免疫染色；出生前后卵巢内的基质细胞和前体颗粒细胞中均可检测到P450（SCC）的免疫染色，伴随卵泡发育，产后10d的小鼠卵巢次级卵泡膜细胞开始出现P450（SCC0的免疫染色，并随着日龄的增加而逐渐增强；临近性成熟小鼠卵巢内较大的有腔卵泡颗粒细胞也开始出现P450（SCC）的免疫染色。研究结果初步阐明了P450（SCC）在卵巢内的发生时相和表达模式；产后小鼠卵巢内P450（SCC）伴随次级卵泡膜细胞的形成而发生；优势卵泡排卵前的成熟发育进程中壁层颗粒细胞逐渐获得表达P450（SCC），进而分泌孕酮的能力。     

油菜叶片衰老相关基因的分离：细胞色素P450cDNA的克隆和序列 …

通过绿叶和衰老叶片ｃＤＮＡ的缩减杂交和差别筛选，富集并分离了缩减ｃＤＮＡ文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段。以目的基因片段为探针，通过筛选油菜衰老叶片的ｃＤＮＡ文库，分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长ｃＤＮＡＬＳＣ４６。     

4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢

以毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷为供试农药,以斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼为供试生物,研究了3种农药对4种鱼的急性毒性,4种鱼肝细胞色素P450对3种农药的脱硫代谢作用及两者之间的相关性。结果表明,毒死蜱对于上述4种鱼的96hLC50分别为1.94、0.171、0.0273、0.0681mg·L^-1;对硫磷为2.6、0.0559、1.78、1.02mg·L^-1;马拉硫磷为7.07、0.907、6.03、0.172mg·L^-1。4种鱼肝脏P450对于毒死蜱代谢的Vmax/Km值分别为1.67×10^4、2×10^4、5×10^4、2×104min^-1;对于对硫磷代谢的Vmax/Km值分别为2×10^4、5×10^5、1.11×10^5、1.43×10^5min^-1;对于马拉硫磷的值分别为5×10^3、5×10^4、2.5×10^3、1.67×10^4min^-1。96hLC50值与Vmax/Km值大体呈负相关,其中毒死蜱的相关性较弱,对硫磷及马拉硫磷的相关性较强（R^2值分别为0.2181、0.8490、0.5102）。研究结果说明P450在鱼类耐药性形成过程中发挥了阻碍作用。     

苦荞细胞色素CYP81家族同源基因FtP450-R4的克隆、分子鉴定及其功能分析

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNAends,RACE)技术,获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号:KM271986).FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5'-UTR为49 bp,3'-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3'H的特征基序(GGEK);系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌(Escherchia coli) BL21 (DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料.     

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因（XM₀02525863.1）的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。     

槲皮素对四氯化碳致建鲤肝细胞损伤的保护作用

本研究旨在探讨槲皮素(quercetin,QC)对化学性肝细胞损伤的保护作用。1,1-二苯基-2-苦基苯肼基自由基(1,6-Bis(diphenylphosphino)hexane,DPPH)在本实验中用来测定槲皮素的自由基清除能力。8mmol/L四氯化碳(CCl4)用作体外诱导剂,构建建鲤(Cyprinus carpio)肝细胞损伤模型。原代培养的肝细胞分别用不同浓度的槲皮素(0.05、0.1和0.2 mg/mL)进行前处理,后处理及前后处理,检测培养上清指标酶((谷草转氨酶(aspartate transaminase,GOT)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,GPT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenas,LDH))及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD))的酶活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的释放量,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法测定细胞中细胞色素P450 1A(CYP1A)、3A(CYP3A)及白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)m RNA表达量,Western blot测定核转录因子-κB(NF-κB)成员c-Rel和p65的蛋白表达量。结果显示,低浓度的QC即可高效地清除DPPH,表明QC具有较强的自由基清除能力。QC可以显著提高细胞活力及SOD活性,且有效地降低了GOT、GPT、LDH和MDA的含量;同时,QC也显著地抑制了CYP1A和CYP3A的表达,对c-Rel和p65及其下游细胞因子的转录也起到了显著的抑制作用。数据统计分析显示,前处理组效果最佳,前后处理组效果次之,后处理组稍差,各组中0.1和0.2 mg/m L槲皮素的抑制效果最明显。综合以上结果,QC对建鲤化学性肝损伤有一定的保护作用。实际生产中,可将槲皮素开发成一种饲料添加剂,以增加水产动物的抗病能力。     

利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达

本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73％、52％和85％;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台.     

不同施肥模式对菜—稻轮作农田土壤磷素径流损失与表观平衡的影响

采用田间小区定位试验(2015—2016年)研究了自然降雨条件下农户习惯性施肥(T1)、减量施肥(T2)及优化施肥(T3)不同施肥模式对太湖流域菜—稻轮作农田土壤磷素径流流失特征和磷素表观平衡的影响。结果表明:菜—轮作农田地表径流排水主要分布于强降雨(梅雨季、台风季)集中的水稻生长季,与降雨量呈显著线性正相关关系。磷素径流流失也集中在水稻季,各处理条件下,其流失量占周年流失总量的比例达74.75%~81.46%。农户习惯性施肥模式(T1)处理条件下,蔬菜季径流总磷平均浓度(0.55mg/L)显著高于水稻季(0.29mg/L),但磷素径流流失量(0.49kg/hm^2)却显著低于水稻季(2.13kg/hm^2)。减量施肥(T2)和优化施肥(T3)模式处理可显著降低蔬菜季、水稻季径流磷素浓度和菜—稻周年磷素径流流失量。较T1处理,T2和T3处理显著降低菜—稻周年TP径流流失量分别达22.48%和45.66%。菜—稻轮作农田土壤磷素盈余量呈现显著的施肥模式差异和季节差异,周年盈余量高达260.90kg/hm^2,且主要集中在蔬菜生长季(70.63%)。较T1处理,T2、T3处理显著降低周年磷素盈余量达38.47%~64.87%(P<0.05)。同时,虽然蔬菜产量在T2、T3处理下均显著下降,但较T2处理,T3处理对蔬菜、水稻及周年产量均无显著影响。可见,菜—稻轮作种植模式下,蔬菜季施用适量生物炭,稻季不施磷具有磷素减排、维持作物稳产和磷素表观平衡的协同效应。     

有机肥施用对菜地磷素径流流失及磷素表观利用率的影响

采用田间小区定位试验(2011—2012年)研究了自然降雨条件下有机肥施用对太湖流域典型蔬菜地磷素径流流失、蔬菜产量及磷素表观利用率的影响。结果表明:冬瓜种植季内菜地径流水量可达1 800~3 528m~3/hm~2,且与降雨量呈显著线性正相关关系。单施化肥(T1)处理条件下,菜地磷素(TP)径流流失量和流失系数分别达3.45kg/hm~2和1.08%,有机肥施用(T2、T3)显著增加TP径流流失量达14.79%和115.36%,而流失系数却降低39.63%(P0.05)和9.11%(P0.05)。从冬瓜产量角度考量,较T1处理而言,有机肥施用(T2、T3)条件下,虽然经济产量和废弃物产量分别提高1.41%~2.88%和4.17%~6.20%,但冬瓜经济系数却稍有下降,但处理间差异不显著。同时,虽然有机肥施用(T2、T3)显著增加冬瓜磷素吸收量达27.27%和46.18%,但磷素表观利用率却显著降低36.79%和61.22%(P0.05)。有机肥施用显著增加菜地磷素盈余,T2、T3处理条件下,盈余量高达238.44~496.28kg/hm~2,分别达T1处理的2.60倍和5.42倍。     

蛋鸽雌激素受体基因多态性与产蛋量关联分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)是核受体超家族中的一种配体依赖的转录因子,大量研究显示,ESR基因与动物的繁殖活动密切相关.为了分析ESR基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)及其与蛋鸽(Columba livia)产蛋量的关系,本研究以泰平王鸽(C.livia)215个样本为研究对象,采用第一代测序法对ESR基因部分片段进行SNPs筛选.在所测的3个片段中共发现了10个突变位点,分别为ESRα基因的T129416C,ESRβ基因的T365C、A388G、C389A、A429G、G451A、G577A、T672C、A923C和T17167C,其中有3个突变位于外显子上,但只有位点G577A导致了氨基酸的改变,由氨基酸异亮氨酸(isoleucine,Ile)转变为缬氨酸(valine,Val).对10个位点进行了Hardy-Weinberg平衡状态检验,结果显示,所有位点均处于平衡状态.10个位点的连锁不平衡分析显示,位点S2与位点S4、S9为强连锁不平衡(D'≈1,r2＞0.8),位点S4、S9可以完全代表S2.多态位点与产蛋量关联分析显示,位点S8与产蛋量呈极显著相关,其中杂合子AB型的平均产蛋量极显著的高于纯合子AA型(P＜0.01);而纯合子BB型的平均产蛋量低于AB型,高于AA型,但差异不显著(P＞0.05).本研究表明,ESRβ基因中位点S8可作为蛋鸽产蛋量性状选育的候选分子标记位点,为蛋鸽的分子标记辅助育种提供资料.     

黑籽南瓜基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建及分析

黑籽南瓜(Cucurb ita ficifolia)具有很强的抗逆能力,对低温、干旱、贫瘠土壤以及瓜类枯萎病等逆境均具有较强的抗性,这些优良的抗性基因很难通过有性杂交转移到其它瓜类作物上,但可通过可转化人工染色体(TAC)以大片段的形式转化到其它瓜类作物中.本研究利用TAC载体构建了黑籽南瓜基因组DNA文库,该文库包含57 560个克隆,保存在150块384孔板中,其库容量相当于黑籽南瓜基因组的7倍.TAC文库克隆插入片段大小分布范围为20～100 kb,超过40 kb插入片段克隆占40％以上,插入片段平均大小为45kb.在挑取的15个TAC克隆中无空克隆;细菌继代培养30、60和100代后质粒的酶切鉴定表明,TAC克隆可以在大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10B中稳定复制和保存,说明本研究构建的文库质量较高.该研究结果表明,TAC文库为黑籽南瓜抗性基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等有关研究提供了基础资料.     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

山羊繁殖季节性相关基因DIO2与DIO3的表达分析

研究表明,2型脱碘酶基因(typeⅡiodothyronine deiodinase gene,DIO2)和3型脱碘酶基因(type Ⅲiodothyronine deiodinase gene,DIO3)对啮齿动物(Rodentia)和绵羊(Ovis aries)的季节性繁殖活动具有重要调控作用.本研究选择常年发情济宁青山羊(Capra hircus)和季节性发情辽宁绒山羊(C.hircus)作为实验对象,应用反转录PCR和定量PCR技术分别对两个基因的组织表达谱及繁殖轴组织中两个基因的表达差异进行检测分析.研究发现,(1)DIO2基因在所研究的24个组织都有一定量表达,DIO3基因主要在小脑、海马、下丘脑、垂体、脑桥以及卵巢和肾上腺等表达,品种间两基因组织表达谱相似;(2)济宁青山羊垂体DIO2基因表达量显著高于辽宁绒山羊(P＜0.05),下丘脑、卵巢表达量也均高于辽宁绒山羊,但两品种间差异不显著(P＞0.05),子宫表达量显著低于辽宁绒山羊(P＜0.05);(3)对于下丘脑组织DIO3基因,则济宁青山羊表达量比辽宁绒山羊明显要高(P＜0.05),而对于卵巢和子宫DIO3基因表达量,则济宁青山羊明显比辽宁绒山羊低(P＜0.05),济宁青山羊垂体DIO3基因表达量低于辽宁绒山羊,但两品种间差异不显著(P＞0.05).本研究提示DIO2和DIO3基因可能与山羊季节性繁殖调控有关,研究结果可为初步揭示山羊繁殖季节性分子调控机制提供参考.     

microRNA-let-7家族在约克夏猪甲状腺生长发育过程中的表达分析

miR-let-7广泛参与动物组织器官发育调控,是研究猪甲状腺发育的重要候选miRNAs。为了研究miR-let-7家族在约克夏猪(Sus scrofa)甲状腺生长发育过程中的作用,本实验一方面通过对不同发育阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)的猪甲状腺组织切片进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),研究甲状腺发育形态学的变化;另一方面,采用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和荧光定量PCR技术鉴定miR-let-7家族在不同生长阶段(胚龄105,出生后60、90、150日龄)约克夏猪甲状腺中的表达。HE染色结果发现,甲状腺滤泡随着日龄的增加逐渐增大。原位杂交结果显示,miR-let-7主要位于甲状腺的滤泡上皮细胞中,并且let-7的表达在出生后有先减少后增加的态势。通过荧光定量PCR结果发现,在生长期随着日龄的增加,let-7d-5p、let-7f和let-7g的相对表达量逐渐上升,let-7c、let-7d-3p、let-7e和let-7i的表达先升后降。研究结果提示,约克夏猪甲状腺miR-let-7的表达直接或间接影响甲状腺激素水平的变化,在甲状腺生长发育中发挥了重要的作用,为深入研究猪的生长发育提供了一个新的思路。