半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)性别控制与全雌育种相关研究需要一种快速、准确的性别特异分子标记。本研究通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星标记筛选,得到Z、W染色体同源片段相差35bp的位点,对其进行克隆和测序,针对所得测序结果,重新设计引物进行序列特异扩增区间(sequence characterized amplified region,SCAR)转化,增大35 bp差异片段在扩增片段中的所占比例;并摸索得到4%琼脂糖凝胶,150 V,25 min为最适电泳条件,所得SCAR标记可在雌性个体中扩增出169和134 bp两种DNA条带,雄性个体中扩增出169 bp DNA条带,超雌个体中扩增出134 bp DNA条带;将其应用于生产实践中,对半滑舌鳎生理雄性亲鱼576尾进行快速检测,在保证存活的前提下,剔除了亲鱼中的100尾伪雄鱼,有助于提高后代的雌性比例。本研究所得半滑舌鳎性别特异SCAR标记,可用于实验室对半滑舌鳎雌性、雄性和超雌个体遗传性别的准确测定和养殖场简易环境下养殖亲鱼雄鱼中伪雄个体的快速检测。     

一种快速鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)遗传性别快速准确鉴定的方法是性别控制与高雌苗种培育的基础,其性别决定机制为ZW型,遗传雌鱼为异型染色体ZW,遗传雄鱼为同型染色体ZZ.本研究在半滑舌鳎全基因组测序结果的基础上,通过分析Z染色体和W染色体差异序列,设计一对跨Z/W染色体同源差异DNA片段的引物CS-SEX-F和CS-SEX-R,取半滑舌鳎部分鳍条通过碱煮沸方法获得的DNA为模板,采用PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳方法鉴定半滑舌鳎遗传性别.通过该方法在遗传雄鱼(ZZ)个体中可以扩增出366 bp的DNA条带,遗传雌鱼(ZW)个体中可以扩增出366和253 bp两种DNA条带.本研究建立了一种新的成本低廉、操作快速、结果准确可靠的鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法,该方法与已有方法相比,操作简便省时,为半滑舌鳎遗传学研究与性别控制育种相关研究提供了可靠分子标记,在半滑舌鳎遗传性别鉴定和养殖场所内伪雄鱼快速检测方面具有广阔的应用前景.     

半滑舌鳎3D-BAC池构建及性别连锁标记的物理定位

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属于雌配子异形染色体性别决定机制(ZW/ZZ),其W染色体包含的大量重复序列阻碍了W染色体序列的精确组装.目前只有物理图谱可以有效地解决由重复序列所造成的组装难题.本研究在已有物理图谱和遗传图谱的基础上,利用3D(three-dimensional)-BAC(bacterial artificial chromosome)池构建和PCR筛选策略进行了性别连锁标记的物理定位.首先将所选44个384孔板的BAC克隆进行接种和预培养,再接种到4个96孔深孔板中.将每两个384孔微孔板的BAC克隆分别汇集获得相应的板池、行池和列池,在提取DNA后,再将相应板池的部分DNA混合得到超级池.最终构建的3D-BAC池,共包括22个超级池和440个基池,覆盖半滑舌鳎基因组4.2倍,完成一个阳性超级池的基池筛选只需24个反应(20个BAC基池和4个对照).然后选用159个半滑舌鳎性别连锁标记对这些克隆池进行两步PCR筛选.在对超级池的筛选中,有142个标记获得阳性扩增.对这些阳性超级池进行基池筛选后,最终有100个标记得到准确定位.定位到半滑舌鳎物理图谱的84个重叠群(contigs)和20个单个克隆(singletons)上,共计1 760个克隆,包含有21 927个共享条带,物理长度为42.4Mb,覆盖半滑舌鳎基因组约5.3％;确定一个定位关系(contig与标记之间的)平均使用了2.2个克隆.在这些标记中,有17个同时定位到了两个或两个以上的contigs上,有11个标记同时定位到contigs和singletons上.另外有19个contigs定位了2个或2个以上标记.这些性别连锁标记的物理定位将有助于半滑舌鳎性染色体基因组序列的精确组装.     

不同供氮水平下小麦苗期叶绿素含量的QTL及互作研究

由小麦近缘物种硬粒小麦和节节麦发展而来的W7984和现代栽培种Opata.85作亲本,通过一粒传而获得F7重组近交系(RIL)群体。对该群体的111个株系分别在正常供应氮素(N.4.0mmol/L)和低氮胁迫(N.0.4mmol/L)两种情况下进行培养,4周后测定叶片叶绿素含量。根据该群体而构建的遗传图谱包括覆盖整个染色体组的918个RFLP(限制性片段长度多态性)标记,应用这些标记,研究了两种供氮情况下小麦叶片叶绿素含量的QTL(数量性状基因位点)及基因间互作。结果表明,在氮素正常供应情况下,有7个与叶绿素含量有关的QTL,变异解释率在4.30％～13.45％,亲本双方对于叶绿素含量的贡献基本一致;在氮素胁迫下,有9个QTL与叶绿素含量有关,变异解释率在4.04％～11.73％,亲本W7984.对于叶绿素含量的贡献占主导地位。表明小麦近缘物种在低氮胁迫下对于叶绿素含量有重要贡献;且低氮胁迫下,叶绿素含量还受基因间上位效应的影响。氮素正常供应时有1个位点(位于2B染色体上)、低氮胁迫下有2个位点(位于3A和3B染色体上)同时影响小麦干物质产量和叶绿素含量,而且此3个位点的效应都来自亲本W7984。这一发现表明,小麦干物质产量和叶绿素含量之间存在着内在的联系。     

水稻4种农艺性状QTL的初步定位分析

本研究以粳稻品种＂藤坂5号＂与籼稻品种＂江西丝苗＂为亲本杂交构建的F2分离群体（137个单株）作为作图群体,对控制水稻株高、剑叶宽、剑叶长和剑叶长宽比4种农艺性状的QTL进行定位分析。分别在第1、3、4和7染色体上检测到7个QTLs,其中qPH-3、qFLLW-4和qFLW-3在其所控制的相应性状（株高,剑叶宽和剑叶长宽比）所定位到的QTL中的贡献率是最大的,是主效QTL。然而,在本研究中并未检测到控制剑叶长的QTL。这些分析结果为进一步的分析和精细定位奠定基础,为育种和种质创新提供理论依据。     

水稻抗UV—B的QTL定位和环境互作分析

以“Lemont”（美国）和“Dular”（印度）杂交建立的包含123个家系的水稻重组自交系（RIL）群体,构建了含有97对SSR分子标记的水稻遗传连锁图谱。以该遗传群体及其亲本为材料,分别在2005年晚季和2006年早季进行UV—B辐射增强处理,考察了株高性状,并转换成抑制率进行混合线性模型的复合区间作图定位,共检测到2个抗UV—B辐射增强的加性QTLs,分别位于第4和第6染色体上,解释了4．72％和2．69％的遗传变异,分析还发现控制该性状QTL存在环境互作效应,分别解释了8．36％和5．42％的遗传变异,大于加性QTLs。同时检测到7对上位性互作基因,解释了0．00～6．88％的遗传变异,也存在-9环境的互作效应,解释了1．94％～23．31％的遗传变异,暗示着基因上位性的重要作用。     

半滑舌鳎trim36基因cDNA克隆及表达分析

三重基序蛋白(the tripartite motif-containing protein,TRIM)家族是一类结构保守、进化快速的E3泛素蛋白连接酶,参与诸多重要的生命过程.TRIM36是TRIM家族的一员,trim36编码E3泛素蛋白连接酶.本研究在已完成的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序及转录组测序的基础上,利用RACE技术克隆得到半滑舌鳎trim36基因(GenBank登录号:KU244470),序列全长为2 899 bp,其中ORF为2 214 bp,编码737个氨基酸,5’非翻译区(untranslated regions,UTR)为289 bp,3'UTR为396 bp.生物信息学分析显示,半滑舌鳎TRIM36蛋白包含1个锌指结构,2个B-BOX类型锌指蛋白结构域(B-Box-typezinc finger,BBOX),1个卷曲螺旋结构,1个羧基末端的纤连蛋白Ⅲ(fibronectin typeⅢ,FN3)结构域和1个双特异性蛋白激酶spla和兰尼碱受体(spla kinase and ryanodine receptor,SPRY)结构域.此外,在不同脊椎动物中,trim36基因与其邻近的基因具有保守的共线性关系.半定量RT-PCR及qRT-PCR结果显示,在半滑舌鳎不同组织中,trim36基因表达存在差异.trim36在卵巢中表达量最高,其次为雌、雄鱼的脑中;不同发育时期中,trim36基因在120日龄半滑舌鳎性腺中开始表达,且卵巢表达量显著高于精巢(P＜0.05).原位杂交结果显示,trim36基因杂交信号主要出现在Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞.trim36时空表达特征表明,其在卵巢腔的形成及Ⅰ期、Ⅱ期卵母细胞的形成中起重要作用.结果表明,trim36在性别发生方面有一定的作用,这为进一步研究鱼类ttim36基因功能及TRIM家族基因功能提供线索和参考.     

UV-B辐射增强下水稻苗期硅营养性状的QTL定位及其与环境互作效应分析

以"Lemont"和"Dular"杂交建立的包含123个家系的水稻重组自交系(RILs)群体为材料,选用水稻根系硅吸收能力和叶片硅利用率为指标,进行水稻硅营养遗传性状QTL定位,并分析其与UV-B辐射增强的互作效应。结果表明,控制水稻叶片硅利用率的4个加性QTL分别在第2、3、10染色体上,而控制根系硅吸收能力的1个加性QTL位于第11染色体上。QTL与UV-B辐射互作分析发现2对控制根系硅吸收能力和3对控制叶片硅利用率的基因×环境上位性QTL,其中只有1对控制根系硅吸收能力的QTL效应值较大。说明水稻这两种硅营养性状中,根系硅吸收能力较叶片硅利用率受UV-B辐射影响大,在抗UV-B辐射育种中以叶片硅利用率为水稻硅营养遗传选择的指标具有较高效率。     

小麦株高发育动态QTL定位及其与水分环境互作遗传分析

株高是影响小麦产量的重要农艺性状,对生境水分极为敏感。为探讨小麦不同发育时期株高数量性状遗传与水分环境互作,本研究利用抗旱性强的冬小麦(Triticum aestivum L.)品种陇鉴19与水地高产品种Q9086杂交,重组近交系(RIL)群体120个株系为供试材料,测定两试验环境(甘肃镇远和兰州)雨养(干旱胁迫,DS)和灌溉条件下不同发育时期株高,采用条件复合区间作图法进行株高发育动态数量遗传位点(quantitative trait loci,QTL)分析。共检测到26个条件加性QTL(A-QTL)和56对上位性QTL(AA-QTL)。在A-QTL中,Qph.acs-1A-1、Qph.acs-4B-2、Qph.acs-5A-1、Qph.acs-5D-1、Qph.acs-6B-2和Qph.acs-7D-1在开花期前能重复表达,且有相对较高的贡献率(H2(A))(7.39%~31.04%)。AA-QTL主要由非显著加性效应的位点间互作形成,贡献率(H2(AA))在1.38~24.27%之间,这些AA-QTL效应对后期株高有显著影响。有61.54%的A-QTL和58.93%的AA-QTL分别参与了水分环境互作,在雨养条件下普遍具有降低株高的效应。条件A-QTL的加性效应在拔节期最大,随后逐渐降低,更多的体现出上位性效应。说明控制小麦株高发育的数量性状基因易与水分环境发生互作,且在小麦不同发育阶段有不同的时空表达模式。本研究结果可为小麦抗旱遗传研究与分子改良提供基础资料。     

水稻赖氨酸和总黄酮含量的QTL定位及环境互作分析

为挖掘多环境下稳定存在的水稻赖氨酸和总黄酮含量相关QTL,以粳稻东农425和长白10号及其衍生的180个株系的F_(6:7)重组自交系(RIL)作为供试群体,采用完备区间作图法(ICIM)和基于混合线性模型的复合区间作图法(MCIM),对2014年和2015年水稻的赖氨酸含量和总黄酮含量进行加性QTL定位及环境互作分析。结果检测到10个影响赖氨酸含量的加性效应QTL和12个影响黄酮含量的加性效应QTL,分布在除第9、第10和第12染色体以外的9条染色体上,其中在第5染色体的RM538~RM1271标记区间内连续2年检测到总黄酮含量QTL。检测到6个存在环境互作效应的赖氨酸含量QTL、4个存在环境互作效应的总黄酮含量QTL,互作贡献率为0.15%~6.73%;一对影响总黄酮含量的上位互作效应的QTL,贡献率为0.99%。本研究结果为水稻赖氨酸和总黄酮含量QTL分子标记辅助育种提供了一定的理论依据。     

不同磷、钾处理小麦苗期氮营养性状的QTL分析

【目的】 对不同浓度磷、钾处理下小麦苗期氮养分效率相关性状进行QTL分析,以深入理解磷、钾与氮养分效率的相互关系,为氮营养相关性状的图位克隆及分子标记辅助选择育种奠定基础。 【方法】 采用苗期液培试验,以“川35050 ×山农483”组合衍生的小麦重组自交系群体(131个株系)为研究材料,设置了中磷中钾(MPMK)、高磷(HP)、低磷1 (LP1)、低磷2 (LP2)、低磷3 (LP3),高钾(HK)、低钾1 (LK1)、低钾2 (LK2)、低钾3 (LK3)共9个处理,对不同磷、钾处理下的氮养分效率相关性状进行研究,并结合分子标记遗传图谱,从整个基因组水平对与小麦苗期氮养分效率相关的10个性状进行QTL定位及遗传分析。 【结果】 不同处理下的10个性状共检测到137个QTL,位于除3D外的20条染色体上,大部分QTL (89.05%)仅在单一处理下被定位到,有3个QTL (QRnue-1A.2、QSnue-1A.1和QTnue-1A.1)可在至少4个处理中被检测到,有5个QTL (QRnue-1A.1、QTnue-1A.1、QSnc-4A、QRnc-6A.3和QSnue-6B)可同时在低磷和低钾环境中被检测到。本研究还检测到至少包含3个以上QTL的QTL簇17个,分别位于1A、1B、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5D、6A、6B、6D和7A染色体上,共涉及66个QTL,占QTL总数的48.18%。其中,有5个QTL簇仅与特定磷、钾处理有关,大多数QTL簇均同时定位了不同磷、钾处理的不同性状,许多QTL簇位点还与前人定位的生物量、产量及其他养分有关。 【结论】 磷、钾的供应能够显著影响小麦苗期对氮素的吸收利用及其相关QTL的表达。影响苗期小麦氮养分效率相关性状的QTL大多数仅在特定处理下被检测到,但大多数QTL会形成QTL簇,构成了控制氮养分效率的QTL热点,许多热点区域也与前人定位的许多成株期性状如生物量、产量及其他养分效率有关,这些QTL/基因密集区域及其特点的发现,为我们深入理解小麦氮养分效率的遗传控制特点及其与磷、钾养分供应的关系提供了新的视角,也为这些重要位点的克隆及其应用提供数据支持。     

水稻苗期不同阶段与低氮耐性相关的QTL分析

以超级杂交稻协优9308(协青早B/中恢9308)的重组自交系(R IL)为材料,通过溶液培养试验检测苗期不同阶段与低氮耐性相关的数量性状基因座(QTL)。结果共检测到14个QTLs,单个QTL可解释的表型变异为7.13%1~3.03%。其中,处理后15 d检测到6个QTLs,分别位于第1、7、1、7、10和11染色体上;处理后30 d检测到8个QTLs,分别位于第3、8、3、10、3、8、10和4染色体上。处理后15 d,在第1染色体RM297-RM212区间检测到同时控制相对冠干重和相对总干重的QTL,与氮循环有关,此染色体区域可能富含关键的氮代谢基因。定位结果表明,两个时间检测出的低氮耐性QTL的差异表达与水稻不同发育阶段基因的时空表达密切相关,从而反映在低氮耐性位点的差异上。     

Quantitative Trait Loci (QTL) of Seed Zn Accumulation in Barley Population Clipper X Sahara

There is little information regarding the chromosomal regions conferring zinc (Zn) accumulation in barley. With the aim of developing markers for Zn accumulation, 150 lines derived from cross between ‘Clipper’ (low-Zn-accumulator) and ‘Sahara’ (high-Zn-accumulator) were screened. In field-grown plants, two regions located on 2HS and 2HL were associated with seed Zn concentration and content. 2HS was flanked by Xbcd175 and Xpsr108; 2HL was flanked by vrs1 and XksuF15 markers. These two regions accounted for 45% of total variation in seed Zn concentration and 59% of total variation in seed Zn content. In a glasshouse experiment, 2HS and 2HL were also associated with seed Zn concentration and content, and explained 37% and 55% of the total variation in seed Zn concentration and content, respectively. The identification of these Quantitative Trait Loci (QTL) provides an important starting point for transferring and pyramiding genes that may contribute to the improvement of barley productivity and nutritional quality in Zn-deficient environments.     

田间条件下控制玉米开花前后根系性状的QTL定位

在田间原位条件下,利用根系形态差异显著的自交系掖478和武312为亲本构建的BC4F3群体,采用改进的PLABQTL软件中的复合区间作图法对抽雄期（开花前10 d）和灌浆初期（开花后15 d）玉米根系性状的变化和地上部生物量进行QTL定位。并分析其遗传机制。结果表明,花前花后对根干重、总根长、侧根长、轴根长、轴根数等根系性状共检测出27个QTL,单个QTL贡献率为52%157%,其中在染色体臂602和1004区域同时检测到控制着地上部生物量、总根长、侧根长和轴根数等性状的QTLs,两个不同生育时期检测到的共同QTL共有8个。玉米花前花后控制根系生长的QTL因生长发育阶段不同而存在着特异性,而且对地上部生物量形成有重要贡献,这为了解田间条件下根系的生长发育和进一步进行遗传改良奠定了遗传基础。     

施氮与不施氮条件下玉米开花期相关性状的 QTL 定位

【目的】 探究施氮与不施氮对玉米开花期相关性状变异的影响,并定位相关 QTLs。 【方法】 以玉米的骨干自交系综 3 为供体亲本,许 178 为受体亲本,通过杂交、回交和分子标记辅助选择的方法,构建了一套以许 178 为遗传背景的综 3 染色体单片段代换系 (SSSLs) 群体,其中包含 160 个单片段代换系。以这套 SSSLs 以及许 178 为材料,采用裂区试验设计,在施氮 (N+) 和不施氮 (N–) 条件下,通过一年三点 (贵州贵阳、德江和云南罗平) 的表型评价,利用复合区间作图法对玉米散粉期、吐丝期和散粉–吐丝间隔期 (ASI) 3 个开花期相关性状进行 QTL 定位。 【结果】 在基因组范围内,2 种氮处理条件下共定位到 54 个开花期相关性状 QTLs,主要定位在第 1、3、6、9 和 10 染色体上。其中 5 个 QTLs 在 3 个环境中均被检测到。施氮条件下,吐丝期 (DTS) 相关位点qDTS9a,位于第 9 染色体,可解释表型变异的 3.05%;吐丝散粉间隔期 (ASI) 相关位点qASI10a,位于第 10 染色体,可解释表型变异的 30.74%。不施氮条件下,散粉期 (DTP) 相关位点qDTP9,可解释表型变异的 3.43%;吐丝期相关位点qDTS9a,位于第 9 染色体,可解释表型变异的 4.08%;ASI 相关位点qASI10,位于第 10 染色体,可解释表型变异的 50.28%。对不同处理条件下的定位结果比较发现,不施氮条件下检测到的 QTLs 数目显著高于施氮条件下的检测数量。 【结论】 不同氮素处理下存在一些共有的控制玉米开花期相关的遗传区段,分别位于 Bin9.02 (umc1170-umc1636-bnlg1401-umc1271) 和 Bin10.04 (umc1077-umc1053-umc2350),这些区段可能在玉米氮素吸收、转运和利用过程中起重要作用,可作为下一步精细定位和图位克隆玉米开花期相关基因的重要候选区域。      

梅山猪氨肽酶基因N(pAPN)cDNA克隆、序列分析及重要变异位点的筛选

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点,本研究通过PCR扩增和测序技术,结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点,对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明,梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp(GenBank登录号:KF280271),含有20个外显子,编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号:NM_214277.1)相比,梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域,Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现,pAPN为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸,二级结构元件以α螺旋和β折叠为主,编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选,为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。     

玉米品种(系)的主要性状分析

玉米在粮食生产中占有极为重要的地位。为进一步研究玉米品种(系)的适应性,筛选出适应大面积种植的玉米品种(系),在90 000株/hm2的种植密度下,运用聚类分析、相关性分析等方法对13个玉米品种(系)的农艺性状及产量构成要素进行了分析。结果表明,甘肃农业大学应用技术学院正在选育研究中的玉米品种T7穗叶夹角和叶面积低于平均值19.24%、3.93%,表现株型紧凑。T7、T6的产量高于平均值8.25%、7.85%,这2个品种(系)群体增产效果明显,可在该区域作为主导玉米品种种植。