大赖草总DNA转化小麦叶片mRNA差异显示技术中总RNA提取和反转录活性研究

[目的]研究大赖草总DNA转化小麦叶片mRNA差异显示技术中总RNA的质量及反转录活性。[方法]在大赖草总DNA转化小麦幼苗叶片mRNA差异显示相关试验中,利用改进的TRIzol法,从幼苗叶片中提取总RNA,紫外光谱分析,1.2%琼脂糖电泳检测,并进行随机引物RT-PCR扩增。[结果]OD260 nm/OD280 nm比值为1.95～1.98;总RNA和RT-PCR电泳条带均表现出整齐、清晰。[结论]获得的总RNA质量好、纯度高,有很高的反转录活性,完全适合于进一步的分子生物学研究。     

水稻叶片mRNA差异显示技术中总RNA的提取和检测

水稻叶片mRNA差异显示技术中,叶片总RNA的质量是十分关键的因素,介绍水稻叶片mRNA差异显示相关试验中,叶片总RNA提取和检测的方法及需要注意的一些问题。     

凡纳滨对虾总RNA完整性的正确评估

凝胶电泳技术通常被用于总RNA完整性检测,一般认为28S和18S rRNA条带亮度的比值大于等于2表示总RNA完整性良好,该比值越小表明总RNA降解越严重。为了检测这一标准在水产虾蟹类中是否继续适用,分别对凡纳滨对虾rRNA和mRNA的完整性进行了分析。用TRIzol分离纯化的凡纳滨对虾总RNA经凝胶电泳检测,发现其28S:18S rRNA的比值远小于2;但是以同样的总RNA为模板进行RT-PCR,能顺利扩增出长约1 100 bp的ACT和eEF1A基因序列。进一步的3':5'分析显示这2个内参基因mRNA的3':5' ratio分别为2.79和1.53,直接表明被测mRNA完整性良好。因此,凝胶电泳低估了水产虾蟹类总RNA的完整性,建议采用3':5'分析技术对水产虾蟹类总RNA完整性进行检测。     

油茶优良无性系的RAPD分子鉴别

油茶优良无性系是当前生产上的主要良种．通过采用RAPD分子标记方法。从180多个引物中筛选出22个具有多态性的随机引物进行扩增。得到141个位点。其中有91个是多态位点。以此为基础建立油茶优良无性系的RAPD分子鉴别体系．同时还探索出油茶叶片总DNA的分离技术和建立了RAPD反应体系，为油茶分子技术育种积累了相关的知识并奠定了DNA技术基础．     

一种简单经济的提取水稻未成熟种子RNA的方法

多糖污染是从田间水稻叶片和未成熟种子等高含糖组织中提取高质量RNA的主要限制因素.我们介绍一种简单经济的RNA提取方法,它适合从水稻叶片和未成熟种子这些富含多糖的组织中提取总RNA.这种方法可以克服产率低和质量低的问题.RNA提取后经过电泳和分光光度计分析结果表明,每克水稻组织总RNA产率在520 μg到800 μg之间,OD260/230比值大于2.0,OD260/280比值大于1.9.提取的RNA可以用于体外反转录cDNA、mRNA分离和基因表达系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE）库的构建.     

杜仲树皮总RNA提取方法的比较

[目的]从杜仲树皮中获得高质量的总RNA。为开展杜仲后续mRNA分离、杜仲抗真菌蛋白基因克隆、及杜仲树皮cDNA文库构建等研究奠定基础。[方法]以杜仲树皮为材料,分别采用改良CTAB-LiCl法、RNApure Plant Kit法和RNAiso Plus法进行总RNA提取,用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性,用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率。[结果]改良CTAB-LiCl法和RNA-pure PlantKit法提取的杜仲树皮总RNA纯度和完整性较高,A260/A280值均在1.800~2.000,28和18 SrRNA条带清晰,RNA得率较高;而RNAiso Plus法提取的杜仲树皮总RNA的纯度和完整性较低,A260/A280值为1.652,28S和18S rRNA条带存在降解和弥散现象,RNA得率低。[结论]改良CTAB-LiCl法和RNApure Plant Kit法抽提获得的杜仲树皮总RNA质量较高,能满足后续RT-PCR和RACE等试验的要求,这为成功克隆杜仲相关基因奠定了基础。关键词杜仲树皮;RNA提取;方法;比较     

从绵羊脂肪组织提取总RNA方法的改进及应用

以绵羊脂肪组织为材料,对脂肪组织总RNA提取方法进行了改进,并分析了脂肪酸合成酶基因(fattyacid synthase,FAS)在绵羊腹部皮下脂肪组织、肠系膜脂肪组织和尾部脂肪组织中表达的差异性.结果表明:利用改进后的方法从绵羊脂肪组织中提取出的RNA无DNA污染、均一、完整、质量可靠.绵羊腹部皮下脂肪中FASmRNA的表达量极显著高于尾部脂肪组织和肠系膜脂肪组织(P<0.01),且尾部脂肪组织和肠系膜脂肪组织中FAS mRNA的表达量差异不显著(P>0.05).     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料。采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN；用磁珠法分离得到纯化的mRNA；在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA；经与质料载体重组和转化大肠杆菌。成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库．经检测，文库存容量达10^6组率为88．21％．测序结果表明：克隆片段长度一般都大于600bp。说明构建的文库质量较高，能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要．为进一步研究奠定了．很好的物质和技术基础．     

草莓不同组织RNA提取方法的改良研究

探讨一种适于草莓不同组织的RNA提取的改良方法。通过增加裂解液震荡强度、离心柱多次吸附、增加去蛋白液温育次数及漂洗次数等步骤对EASYspin RNA提取总RNA操作方法进行改进。结果表明,改良方法提取的草莓根、茎、叶、果实、花中的总RNA,电泳检测都出现清晰的28S和18S两条明显的条带,表明总RNA完整性较好;紫外分光计分析其OD260/OD280值在1.88至2.06之间,OD260/OD230值均大于2.0,RNA浓度含量为310~500μg/mL,表明提取的总RNA纯度好、含量高;基于RNA中mRNA反转录的RT-PCR扩增Actin基因分析结果表明,改良方法提取的草莓不同组织的总RNA质量高。总之,经过电泳、紫外、反转录分析结果证实,改良EASYspin适于草莓果实等不同组织总RNA的提取,是草莓类似果树种类总RNA提取的首选借鉴方法。     

棉花银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因的有效方法。本研究优化了棉花mRNA的银染差异显示体系,以陆地棉苏棉12为材料,分别提取叶片和开花期后10 d左右的纤维中的总RNA,利用差显技术筛选出了在棉花纤维中差异表达的cDNA片段。     

猪白细胞介素-8荧光定量PCR检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出猪白介素（IL）-8基因的278 bp cDNA片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有猪IL-8 cDNA片段的重组质粒。通过质粒的Real-time PCR方法,建立猪IL-8 cD-NA的Real-time PCR标准曲线。该方法特异性强、灵敏度高、重复性强,可用于猪IL-8 mRNA含量的定量检测。     

胃泌素RT-PCR方法的建立及同源性分析

从猪胃窦和十二指肠提取总RNA,采用美国Am b ion RNA公司生产的Q uan tum RNA class ic 18S为内标,建立了半定量RT-PCR方法,并对胃窦和十二指肠胃泌素mRNA进行了定量检测、测序和比较分析。结果表明,扩增的猪胃窦和十二指肠胃泌素核苷酸序列与猪前胃泌素(propregastrin)核苷酸的同源性达到99%。将其与已发表的人、牛、大鼠和小鼠等物种相应序列的比较结果表明,无论是核苷酸水平,还是氨基酸水平,都显示出了较高的同源性(80%~99%)。另外,建立的RT-PCR方法灵敏度高,操作快捷方便,可用于定量检测少量的组织样品中低丰度表达的胃泌素mRNA。     

适于葡萄不同组织RNA提取方法的筛选

比较了CTAB法、改良CTAB法、Trizol法、SDS-苯酚法和改良SDS法5种RNA提取方法提取葡萄叶片、花序、茎尖、卷须和果实组织RNA的效果。并进一步从总RNA中分离出了高质量的低分子量RNA(LMWRNA),建立了葡萄LMWRNA提取的方法。改进后的改良SDS法能够克服果实中RNA提取难度大的问题,能够从果实中提取到质量和产量都很高的RNA。结果表明,改良SDS法适用于葡萄叶片、花序、茎尖、卷须组织中总RNA的提取,改进的改良SDS法是从果实中提得LMWRNA较佳选择。在总RNA提取的基础上建立的葡萄LMWRNA提取方法能够达到研究的要求。     

基于转录组SNP构建油茶主要品种资源的分子身份证

【目的】近年来,油茶（Camellia oleifera）产业发展迅速,已成为中国四大油料之一。油茶良种不断涌现,但品质参差不齐,“同名异物、同物异名”等现象时有发生。建立油茶品种资源的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism,SNP）分子标记数据库,筛选重要SNP位点,开发油茶品种资源DNA指纹图谱,构建油茶品种资源的分子身份证,为品种鉴别、品种追溯等提供分子水平鉴别技术支撑。【方法】以221份普通油茶品种资源为材料,提取未成熟种子RNA,进行转录组测序。以二倍体南荣油茶基因组为参考,识别供试油茶品种资源的SNP位点并基因分型,利用SNP数据分析油茶群体及亚群的遗传多样性,分析SNP位点的观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量（PIC）等信息,筛选核心SNP位点并采用Sanger测序验证,得到最优SNP位点组合后,结合品种资源基本信息构建油茶品种资源分子身份证。【结果】从油茶转录组中共检测到1 849 953个高质量SNP位点。群体遗传多样性分析发现,油茶群体观测杂合度为0.2966,期望杂合度为0.2462,固定指数为-0.2048,PIC为0.2...     

海蓬子盐胁迫初期抑制消减杂交cDNA文库的构建

为提高缩叶肉质盐生植物海蓬子总RNA和mRNA的质量,将改良CTAB法与Tripure试剂盒方法相结合,从300 mg海蓬子发芽后20 d的幼苗中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA。并以无NaC l处理为D river,以200 mmol/L NaC l处理24 h、48 h、72 h的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增,富集到两组处理中差异表达的大小在200~1 300 bp的cDNA序列,pGEM-T的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重组率分别达到2.6×107和96%,共收集阳性克隆12 000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库。随机挑取酶切质粒的电泳分析表明,载体中均有插入片段。两种RNA提取方法的结合有效提高了多汁多色素海蓬子RNA的质量,高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗盐基因奠定了基础。     

油茶CoFAD2-1基因的克隆、亚细胞定位及组织表达

【目的】克隆油茶CoFAD2-1基因,并进行亚细胞定位和组织表达研究。【方法】采用CTAB法提取油茶4种组织中的总RNA;运用RT-PCR方法,设计基因特异性引物,从油茶未成熟胚中克隆CoFAD2-1基因;用生物信息学手段分析了CoFAD2-1基因的结构和进化关系;利用实时荧光定量PCR技术研究CoFAD2-1基因在不同组织的表达;同时运用烟草瞬时表达技术对该基因进行亚细胞定位分析。【结果】该基因编码区全长为1 149 bp,共编码382个氨基酸,具有FAD2基因家族保守的3个组氨酸簇。系统树分析显示该基因与种子特异表达的FAD2基因聚在一起,组织表达分析也表明CoFAD2在种子中特异表达,转化烟草叶片验证CoFAD2-1蛋白定位于内质网膜上。【结论】CoFAD2-1基因在种子中特异性表达,且定位在内质网膜上。     

猪Ghrelin的基因克隆及其组织中mRNA分布的研究

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA,根据已发表的猪Gkklin mRNA序列设计合成引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了282bp的片段,克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA。检测结果表明：初生仔猪的下丘脑和90d生长猪下丘脑、胃底部、十二指肠、空肠、回肠、胰腺、肝脏、肾脏、心脏等部位组织中均有Ghrelin mRNA分布。     

油茶栽培及管理技术要点

油茶具有较高的经济价值和生态价值，对林业经济发展起到促进作用。在油茶栽培过程中，要加强栽培管理，提高油茶产量。本文从造林地选择、林地整理、苗木选择、松土除草、修剪施肥及病虫害防治等环节对总结油茶栽培管理技术进行总结，以期对油茶栽培提供参考。     

胡杨、柽柳总RNA提取方法的建立

以胡杨和柽柳的叶片为材料，建立了一种从植物组织中快速分离总RNA的方法。该方法具有三个显著的特点：RNA提取周期短，应用改进的LiCl沉淀RNA方法，仅需l0min即可；方法简单易行，仅需要几种常用试剂，操作步骤简单；提取的RNA杂质少，得率高，并能在提取过程中较有效抑制RNA的褐化效应。RNA质量可以满足cDNA文库构建、DDRT—PCR等要求。     

一种有效的可口革囊星虫体壁总RNA提取方法

[目的]为从可口革囊星虫体壁中提取高质量的RNA,以便深入开展分子生物学研究。[方法]采用Trizol法、改良Trizol法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法3种方法提取可口革囊星虫体壁中总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取总RNA的效果。[结果]改良Trizol法提取的总RNA经电泳后能看到清晰完整的28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带,无拖尾现象;而Trizol法和CTAB法提取的总RNA电泳条带完整性较差,缺少28S rRNA。[结论]传统的Trizol法和CTAB法不适用于可口革囊星虫体壁总RNA的提取;改良Trizol法提取的总RNA电泳条带清晰、完整性好,质量符合cDNA合成、RT-PCR扩增等后续实验要求,适用于提取可口革囊星虫体壁总RNA。