黑果腺肋花楸原生质体分离研究

为建立有效的原生质体分离体系,研究了黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)原生质体酶解分离纯化条件。结果表明:黑果腺肋花楸愈伤组织在20g/L纤维素酶+0.5g/L果胶酶+13%甘露醇+5mmol/LMES酶解液中黑暗静置酶解10h,可获得高产量高活力的原生质体;采用500r/min离心8min分离纯化效果最好;愈伤组织比组培苗叶片分离获得的原生质体产量与活力更高。     

月季原生质体分离条件的研究

采用质壁分离和冰冻预处理月季幼叶.用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液分离原生质体,并对影响原生质体产量及活力因素进行分析.结果表明,纤维素酶对原生质体产量有极显著影响,适宜月季幼叶原生质体提取的酶液组合为:纤维素酶1.5%、果胶酶0.5%、甘露醇0.6 mol/L、酶解12 h;质壁分离后,原生质体产量增加,但活力降低;冰冻处理使产量提高,处理12 h时,原生质体活力达到最高.     

毛葡萄原生质体分离与纯化研究

以毛萄萄愈伤组织、悬浮培养细胞,无菌苗幼叶为材料,研究了毛葡萄原生质体的分离纯化方法及影响因素.结果表明,毛葡萄原生质体分离材料以悬浮细胞和愈伤组织最好.毛葡萄愈伤组织在0.5 mol/L甘露醇中预处理90 min,CPW+13%甘露醇+2%纤维素酶+0.25%果胶酶+0.5%离析酶的酶液中酶解10 h,其原生质体产量最高可达6.24×106个/g,活力为86.83%.     

矮牵牛愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化

研究了影响诱导矮牵牛(Petunia hybrid)形成愈伤组织和分离、纯化其原生质体效率的关键因素。结果表明,矮牵牛无菌苗叶片可在含1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和0.1 mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基上形成愈伤组织,用酶液(2%纤维素酶R-10 + 0.5%果胶酶Y-23 + 0.3%离析酶R-10,0.5 mol/L甘露醇)对继代培养10~15 d的愈伤组织在黑暗条件下静置酶解12 h,原生质体产量和活性分别达到3.4×10⁶个/g 和83%。     

酶解时间对灯盏花原生质体产量及活力的影响

原生质体是进行单细胞测序和基因编辑研究的理想材料。为了研究不同酶解时间对灯盏花原生质体分离的影响,采用纤维素酶1%+果胶酶0.3%+半纤维素酶0.5%酶液处理愈伤组织悬浮细胞2,3,4,5,6 h,纤维素酶0.5%+果胶酶0.2%+离析酶0.5%酶液处理幼叶4,6,8,10,12,14,16 h。结果表明,不同酶解时间,灯盏花悬浮细胞和幼叶的原生质体产量及活力均差异显著。悬浮细胞酶解5 h,原生质体的产量和活力达到最高,分别为3.73×105个·g-1、75.84%;幼叶酶解12 h,原生质体产量最高,达到1.17×106个·g-1,酶解10 h,原生质体活力最高,为80.98%。叶片的原生质体产量和活力明显高于悬浮细胞。     

花椒原生质体分离与培养研究

以花椒试管苗叶片、愈伤组织和悬浮细胞为试验材料,通过单因素试验研究酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离的影响,并以花椒试管苗叶片分离出的原生质体为试验材料,研究培养基种类、培养密度、不同激素配比对花椒原生质体培养的影响。结果表明,酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离有显著影响。在适宜条件下,用甘露醇作花椒原生质体分离的渗透压调节剂,浓度在0.6~0.7 mol·L^-1时分离效果最佳。以花椒叶片为原生质体分离材料的最佳酶液组成为CPW-0.7 mol·L^-1甘露醇+1.0%(w/v)纤维素酶R-10+1.5%(w/v)果胶酶,酶解时间为10 h,纯化后的原生质体产量和活力分别可达82.36×10⁵ 个·g^-1和72.74%。以愈伤组织和悬浮细胞为分离材料的最佳酶液组成均为CPW-0.6 mol·L^-1甘露醇+2.0%(w/v)纤维素酶R-10+0.5%(w/v)果胶酶,酶解12~14 h,纯化后的原生质体产量及活力分别为31.26×10⁵ 个·g^-1、59.15%和53.87×10⁵ 个·g^-1、63.92%。以花椒试管苗叶片为原生质体分离材料,分离纯化后的花椒原生质体在无激素的WPM培养基中,培养密度为1×10⁵个·mL^-1,培养第3天原生质体第1次分裂,2周分裂3~5次,原生质体28 d后形成微细胞团,培养60 d后可形成2 mm左右的愈伤组织。     

人参原生质体的分离培养

以人参愈伤组织细胞悬浮系为材料,研究了人参原生质体的分离纯化方法及影响因素.结果表明:以人参愈伤组织细胞悬浮系为材料,在加入1%纤维素酶和0.5%果胶酶、甘露醇浓度0.7 mol/L的酶解液中酶解8 h分离得到的人参原生质体产量最高;采用人参与胡萝卜共培养培养基,进行看护培养成功地培养出愈伤组织.     

石斛兰叶片原生质体分离条件研究

[目的]探讨了石斛兰原生质体分离过程中的影响因素,建立最佳的原生质体制备体系。[方法]以石斛兰叶片为材料,采用正交设计研究纤维素酶浓度、酶解时间、温度、pH值以及甘露醇浓度对石斛兰原生质体分离的影响。[结果]以3%纤维素酶R-10＋0.6%果胶酶Y-23为混合酶液,0.5mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在26℃的黑暗条件下,pH值为5.4的酶液组合中,黑暗条件下振荡,酶解15h,获得的原生质体产量最高。[结论]该制备体系为后续原生质体培养和体细胞杂交奠定良好的基础。     

牡丹叶片原生质体分离条件的研究

以地方品种洛阳红牡丹叶片为材料,通过单因素和正交试验,研究了预处理时间、酶解时间、不同酶组合及酶液中甘露醇含量等因素对牡丹叶片原生质体分离的影响。结果表明:在蔗糖浓度为0.3mol/L的溶液中,预处理0.5h效果最好,(25±1)℃条件下,在0.5%纤维素酶+0.4%果胶酶+0.3%半纤维素酶+10%甘露醇、pH值5.8的混合酶液中,酶解6h所得的原生质体产量最高,有活力的细胞可达2.325×106个/g。     

菜心原生质体游离条件的优化

本研究以发芽4d,生长状况良好,高约4cm的菜心无菌苗为材料,初步研究了菜心幼苗不同部位材料、渗透(甘露醇)浓度、酶解时间、果胶酶、纤维素酶浓度等关键因素对原生质体游离的影响。结果表明,从菜心幼苗的幼叶组织分离原生质体效果比下胚轴好;以w=1. 5%的纤维素和w=0. 4%的果胶酶为酶解液,在0. 8mol/L甘露醇浓度下,40～50r/min的摇床中黑暗酶解4h时,原生质体产量是最高的。     

橡胶树热研8—79原生质体培养再生植株

【目的】优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础。【方法】以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率。【结果】酶组合为纤维素酶1.50%＋果胶酶0.15%＋离析酶0.50%、酶解时间为12 h时,继代培养第5 d的胚性悬浮细胞达最高产量（3.6 ×107个/mL PCV）;用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5 ×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%。原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株。【结论】通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

平菇原生质体制备及再生培养研究

平菇菌丝原生质体的释放以菌龄４～６ｄ的幼嫩菌丝,用２％Ｌｙｗａｌｚｙｍｅ采用０．６ＭＫＣｌ为渗稳剂在ｐＨ值为５．５、温度为３５℃、酶解２～２．５ｈ生长较好,可达１０７个／ｍＬ,孢子释放原生质体在１．５％溶壁酶和１．５％纤维素酶混合作用,同样外界条件下原生质体转化率可达１００％。原生质体再生以２号培养基在０．６Ｍ甘露醇的作用下,用载片悬浮滴式再生法,再生率可达１２．３％。     

酿酒葡萄桂葡一号花粉原生质体分离条件初探

【目的】探索葡萄成熟花粉粒原生质体分离条件,为下一步原生质体杂交及遗传改良提供技术参考。【方法】使用低温—酶解法对酿酒葡萄桂葡一号花粉原生质体进行分离,探讨低温处理不同时间、不同花序位置和不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响。【结果】随着低温处理时间的延长,原生质体分离得率越高,在0.6 mol/L甘露醇条件下,以处理7 d的原质体分离得率最高,达18.94%,其次是处理5 d。对于不同部位花粉,以中上部花药的原生质体分离得率较高,而以中部花序的花粉原生质体分离得率最高,达19.11%;中下部花药及已开始散粉的花药原生质体分离得率较低。相对于1.2 mol/L甘露醇,以添加0.6 mol/L甘露醇作为渗透压处理的花粉原生质体分离得率较高。【结论】低温处理时间、花粉成熟度及甘露醇浓度均对酿酒葡萄花粉原生质体的分离有明显影响。选用即将开花的中上部花药为材料,经0～4℃低温预处理5～7 d,并以0.6 mol/L甘露醇作为渗透压调节剂可获得大量有活性的花粉原生质体。     

茶薪菇原生质体制备条件的分析

以茶薪菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对茶薪菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.4 mol/L KC l作渗透压稳定剂,加入0.20%混合酶(纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在25℃下酶解3 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达2.5×107个/mL。     

西洋参叶肉原生质体的游离与培养

[目的]为了探讨西洋参叶肉原生质体游离和培养的最佳条件。[方法]以5年生西洋参为材料,研究了纤维素酶的种类,酶的浓度和渗透压对西洋参叶肉原生质体游离的影响,并探讨了西洋参叶肉原生质体在KM8P、MS基本培养基中的分裂情况。[结果]在混合酶液其他组分相同的情况下,日本产R-10纤维素酶的游离效果最好。酶浓度为4%时,3 h后大部分叶片都被解离成原生质体。幼嫩叶片的原生质体产量最高,为4.8×105个/g。KM8P培养基适合于西洋参叶肉原生质体的培养,较高的2,4-D浓度可以促进分裂。[结论]用混合酶系统处理,能够获得大量(4.8×105个/g)有活性的原生质体。游离原生质体的酶浓度以1%～2%为宜。KM8P+2,4-D(2.0 mg/L)+6-BA(2.0 mg/L)+KT(0.7 mg/L)培养基适宜培养西洋参叶肉原生质体。     

花生原生质体分离与培养

以花生(Arachis hypogaea L.)品种花育20为材料,探讨不同的酶液浓度、酶解时间及渗透压对花生原生质体分离的影响.结果表明:原生质体分离的适宜酶液配比是2%纤维素酶(Cellulase Onozuka Rs)、0.2%果胶酶(Pectolyase Y-23),甘露醇渗透压调节剂的浓度为0.7mol/L,暗处理10h,叶片原生质体产量为4.86x105个/ml,存活率75.6%,愈伤组织原生质体产量为4.97x105个/ml,存活率75.4%.将分离的原生质体培养在添加1mg/LNAA和4mg/LBAP的改良MS液体培养基中.培养约2～3天后,细胞开始分裂.然后部分细胞继续分裂,并形成细胞团.培养5～6周后,将培养物转移到添加2 mg/L2,4-D和3 mg/L BAP的MS液体培养基(pH5.8)中进行培养.7～8周后,将形成的直径为1～2 mm的小愈伤组织转移到添加1 mg/LNAA和5 mg/LBAP的MS固体培养基上培养,小愈伤组织迅速生长.转移3-4周后,愈伤组织长至7～9mm.     

高大环柄菇原生质体制备的研究

以高大环柄菇为出发菌株,对其原生质体制备条件进行研究,具体分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解时间和温度等因素对高大环柄菇原生质体产出量的影响。结果表明:采用液体发酵培养第5 d的菌丝体,以0.5 mol/L NaC l作渗透压稳定剂,加入1.5 g/L混合酶(即纤维素酶与蜗牛酶按1∶1混合)在30℃下酶解3.5 h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达6.1×107个/mL。     

顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。