草鱼钙网蛋白的克隆与组织表达

钙网蛋白是一种高度保守的分子伴侣蛋白,作为内质网主要的钙结合蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,在病毒、寄生虫感染以及温度、氧气胁迫等情况下对细胞起保护作用。本试验中采用RACE方法首次克隆获得草鱼Ctenopharyngodon idellus钙网蛋白cDNA全序列,其全长为1 389 bp,开放阅读框为1 263bp,编码为421个氨基酸。将获得的草鱼钙网蛋白编码氨基酸序列与其它物种分别进行同源性比较,发现草鱼与斑马鱼Danio rerio、虹鳟Oncorhynchus mykiss的同源性较高,分别为86.26%、76.78%,而与人Homo sapiens、小家鼠Mus musculus的同源性为69.67%、69.19%。通过半定量RT-PCR检测可知,钙网蛋白在草鱼的肌肉、肠道、皮肤、肝胰脏、肾脏、脾脏、鳃和鳍中均有表达,其中在肝胰脏、鳍条中的表达量最高,除与皮肤中的表达量无显著差异外(P>0.05),均显著高于其它5个器官组织(P<0.05)。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长eDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5’端非编码区以及256bp的3’端非编码区．氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79％,与斑马鱼的相似性为75％,与人的相似性最低,为34％．RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱．     

草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

【目的】旨在进一步研究草鱼（Ctenopharygodon idella）莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus, Pim-1)的功能。【方法】采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因（246～318 aa）片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E. coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹（Western Blotting）分析抗体的特异性。【结果】CiPim-1基因序列全长1 082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域（Protein kinase domain...     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

草鱼脂肪酸结合蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

    根据GenBank上已发表的其他物种的脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)基因序列设计1对引物,从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)cDNA文库中扩增出脂肪酸结合蛋白基因,定向克隆于表达质粒载体pET32A中构建成pET32A-FABP重组体,将重组体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以终浓度1 mmol·L-1的IPTG对其进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析表明,与阴性对照相比,阳性克隆在分子量33 kDa处有1条明显的蛋白带,大小与预期结果一致.经光密度分析可知,目的蛋白约占总可溶性蛋白的49.5%.这为进一步研究脂肪酸结合蛋白生物学特性以及FABP基因对脂肪代谢调控规律奠定了基础.     

猕猴桃钙调蛋白cDNA的克隆及测序

以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序更合成５端和３端引物，利用多聚酶锭式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ＣＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列古与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源     

PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

草鱼转铁蛋白受体cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼血清转铁蛋白受体(TfR)序列(NM_001009918)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼TfR cDNA部分序列873bp,获得GenBank登陆号为FJ613322.将测序结果用DNAman软件与斑马鱼的序列进行比对,发现核苷酸同源性为84%,氨基酸同源性为81%.利用半定量RT-PCR技术检测TfR草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、黏液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12种组织的表达差异结果表明,TfR在草鱼12种组织中均可表达,其中在脑与鳍中表达量最高,但与在心脏、性腺中的表达量无显著差异(P0.05),在黏液与鳔中表达量最低,二者之间无显著差异(P0.05).     

草鱼TAB1蛋白的原核重组表达及其抗体制备

为了制备草鱼重组TAB1蛋白(rCiTAB1)及其特异性抗体,首先以草鱼头肾组织c DNA为模板,PCR扩增Ci TAB1基因全长序列,并依次构建重组克隆质粒p MD19-T-Ci TAB1与重组表达质粒pET-32a-Ci TAB1。该重组表达质粒经0.5 mmol·L~(-1) IPTG,37℃诱导表达12 h后获得以包涵体形式表达的重组CiTAB1蛋白(rCiTAB1)。然后,采用3种不同方法对包涵体蛋白进行变性,发现与高浓度尿素直接变性法和洗涤后尿素变性法相比,洗涤后梯度尿素变性法处理后的蛋白纯度最好,经透析复性后得到浓度为2 mg·mL~(-1)的r Ci TAB1。最后,将rCiTAB1蛋白与白油佐剂及免疫增强剂混合,室温下混合1.5h乳化成免疫原,3次免疫新西兰大白兔制备兔抗CiTAB1抗体,经间接ELISA方法和免疫琼脂双向扩散试验测得免疫后第33天血清中特异性抗体的效价分别为1∶1 048 576和1∶16。Western blot检测到一条分子量约为72 kDa的特异性条带,表明该抗体能特异性识别r Ci TAB1蛋白。研究结果为后续深入研究CiTAB1蛋白功能提供了物质基础。     

柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响

用柱状黄杆菌Flavobacterium columnare G4株感染草鱼Ctenopharyngodon idella,分别在感染1、4、7d后提取感染组和对照组草鱼鳃、脾脏、肝脏、肠道和头肾5种组织的总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测不同组织中Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体22(TLR22)3个抗病毒免疫基因的表达变化.结果表明:注射柱状黄杆菌7d后,TLR3在草鱼鳃、肝脏、肠道和头肾4种组织中的表达显著上调(P＜0.05);注射柱状黄杆菌4d和7d后,TLR7和TLR22在5种组织中的表达均显著上调(P＜0.05);而注射柱状黄杆菌1d后,TLR22在鳃、脾脏和肝脏组织中的相对表达量就显著上调(P＜0.05).研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在机体应对细菌感染的免疫反应过程中发挥着重要的作用.     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

饲料中添加赖氨酸甲酯对草鱼生长相关指标的影响

选择健康草鱼Ctenopharyngodon idella 360尾（始重8．34g±0．02g）,按照养殖试验要求分成4组（对照组、A、B、C组）,每组设3个重复,每个重复组放30尾,分别投喂基础日粮（对照组,w（Lys）=1．25％）、添加赖氨酸盐酸盐日粮（A组,埘（Lys）=1．625％）和添加不同剂量赖氨酸甲酯盐酸盐日粮（B组,W（Lys）=1．50％;C组,w（Lys）=1．625％）。结果表明：添加赖氨酸甲酯后,B、C组草鱼的增重率、特定生长率、饲料转化效率和蛋白质效率显著提高（P〈0．05）;鱼体的蛋白质含量和蛋白质沉积率显著提高（P〈0．05）,体脂含量显著降低（P〈0．05）;血清中总蛋白和白蛋白含量显著提高（P〈0．05）,而尿素氮含量显著降低（P〈0．05）。添加晶体赖氨酸的A组,上述指标均未发生显著变化（P〉0．05）。对照组和A组草鱼摄食后,血清中游离赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸浓度在1h左右达到高峰,而B、C组在3h左右达到高峰。     

艾佐迈对草鱼生长、肠道消化酶活性和血清非特异性免疫的影响

在基础饲料中分别添加0%、0.2%、0.3%和0.4%艾佐迈(azomite),饲养平均体质量为(64.20±1.68)g的草鱼(Ctenopharyngodon idella)8周,研究其对草鱼生长性能、肠道消化酶活性和血清非特异性免疫的影响.结果表明:饲料中添加艾佐迈可在不同程度上改善草鱼生长性能,其中添加0.2%艾佐迈使增质量率提高16.65%(P=0.08),饲料系数降低12.90%(P＜0.05);添加0.2%和0.4%艾佐迈可显著提高草鱼的肥满度(P＜0.05);艾佐迈对草鱼肌肉水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量均无影响(P＞0.05);添加0.2%～0.4%艾佐迈可在不同程度上提高草鱼前肠蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性及血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性.其中0.2%艾佐迈添加组可显著提高血清SOD活性(P＜0.05);饲料中添加0.2%、0.3%艾佐迈时草鱼肝胰脏谷草转氨酶(glutamic-oxalaceric transaminase,GOT)和谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)活性无影响(P＞0.05),但添加0.4%艾佐迈组显著降低了肝胰脏GOT、GPT活性.上述结果表明:饲料中添加艾佐迈可提高草鱼的生长性能和血清非特异性免疫力;草鱼饲料中艾佐迈添加量建议为0.2%.     

草鱼CRP基因全长cDNA的克隆及其表达分析

利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520 bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889 bp,含有1个672 bp的开放阅读框,两侧分别有74 bp和143 bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame, ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,结果表明,CRP基因在7种组织中均有表达,表达水平差异不明显.在人工感染24 h后,各组织中CRP的mRNA水平平均升高5倍左右,与哺乳动物和一些鱼类在炎症反应中血清CRP水平升高一致,而人工感染48 h后,除心脏和肌肉组织中有显著降低外,其他组织没有明显变化,仍维持较高水平.     

不同发育阶段草鱼消化酶活力的变化及其昼夜节律

以草鱼为对象,研究了不同发育阶段的消化酶活力及其昼夜变化规律。结果表明:60d组的草鱼肝胰脏及前、中、后肠消化酶活力高于30d组和150d组的;肝胰脏及前、中、后肠蛋白酶活力的峰值分别出现在17:00(1:00)、17:00、1:00、1:00;淀粉酶活力的峰值分别出现在13:00、17:00(5:00)、21:00、21:00(5:00);脂肪酶活力的峰值分别出现在17:00、17:00、17:00、17:00(1:00)。因此认为,草鱼消化酶活力与草鱼生长发育阶段密切相关,具有组织差异性,且呈现明显的昼夜节律。     

草鱼MHC I区基因的表达特征

为全面了解草鱼MHC I区基因及其表达特征,利用已知斑马鱼MHC I区基因序列,通过本地Blast得到草鱼MHC I区的部分基因序列。采用RT-PCR技术,检测MHC I区BRD2、KNSL2、RXRB、TAPBP、FABGL、MHC Ia、PSMB9以及TAP2等8个基因在健康草鱼各组织的表达水平。结果表明,除FABGL在肾脏表达量最高外,其他基因都在血液中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR检测草鱼在嗜水气单孢菌感染后4、12、24、48及96h,MHC I区免疫相关基因在脾脏和肾脏中的表达情况。结果发现,BRD2表达量分别在12h和24h在肾脏和脾脏中达到最高;MHC Ia表达量在脾脏和肾脏中都先上升后下降,并都在24h达最大值;PSMB9表达量在脾脏先上升后下降,在12h达最大值,在肾脏中则先下降后上升,在24h达最大值;TAP2在脾脏和肾脏中整体呈先下降后上升的趋势,在24h都达最大值,并最后都回调至正常范围。BRD2、MHC Ia、PSMB9、TAP2的表达量在攻毒后都有显著性变化,表明这4个基因在草鱼免疫方面具有重要的作用。     

不同饵料蛋糖比对草鱼幼鱼生长性能、体组成和消化酶活性的影响

[目的]研究不同蛋糖比对草鱼幼鱼生长性能、体组成和肠道消化酶活性的影响,为草鱼营养需求研究及饵料配制提供参考依据.[方法]采用单因素设计,以饵料蛋糖比为影响因素,共配制6组等脂等能饵料,对应的蛋糖比值分别为2.00、1.50、1.14、0.88、0.67和0.50.草鱼幼鱼饲养于室内循环养殖系统中,日投饵3次,试验周期8周.[结果]蛋糖比对草鱼幼鱼存活率无显著影响(P>0.05,下同);末体重、增重率和特定生长率受饵料蛋糖比影响显著(P<0.05,下同),均随蛋糖比降低呈先升高后降低的变化趋势,在蛋糖比为0.88时达最高值;饵料系数同样受蛋糖比影响显著,且在蛋糖比为0.88时最低(1.72).随着饵料蛋糖比的降低,草鱼幼鱼蛋白效率比、氮保留率、脏体比、肝体比和腹脂率均显著升高,但对全鱼、胴体的蛋白和灰分含量无显著影响.全鱼水分含量随饵料蛋糖比的降低显著降低,而脂肪含量显著升高;胴体水分和脂肪含量及肝脏脂肪含量的变化趋势与全鱼一致.肠道蛋白酶和淀粉酶活性随着饵料蛋糖比降低呈先升高后降低的变化趋势,脂肪酶活性则显著升高.[结论]草鱼幼鱼饵料中添加适量糖可节约蛋白质,且适宜蛋白质和糖水平分别为30.61%和29.54%,最适蛋糖比为1.04;过高的饵料糖水平能显著增加草鱼幼鱼内脏器官的相对重量,促进体脂过度沉积和糖原合成.