家蚕绢蛋白合成机能的基因调节

Ⅰ研究目的我们已经报告,家蚕绢丝蛋白合成量的差异,由各品种后部丝腺RNA量决定,其RNA量又为DNA量和绢丝腺周围的生理条件所左右(仓田等,1974)。绢丝腺DNA量知随保幼激素类似化合物(以后简称JNA)的给与而增加(仓田、Daillie 1978)。进而更     

家蚕在5令期减食饲育对后部丝腺核酸量的影响

将5令起蚕经3.5天后进行绝食处理(绝食区),5令起蚕摄食时间仅限于每天6小时的饲育(减食区),定量调查蚕儿及绢丝腺的成长,后部丝腺中核酸含量的变化和蚕茧产量。蚕儿的成长体重和后部丝腺,减食区的成长速度大致是对照区的一半,绝食区从开始绝食后便停止生长,重量减少。前、中部丝腺的干物重和按照比例丝液的积蓄比蚕儿生长显著的低。但绝食区的蚕儿绝食后,能暂时地继续增加重量。后部丝腺DNA的增加,每日减量饲育没受到明显地影响;但绝食区却造成了DNA量的减少。关于RNA的积蓄,减食区的最大量约是对照区的70%。绝食区绝食后RNA立刻急速地降低。绝食区减食区的茧质明显地低劣,平均后部丝腺RNA茧丝生成放率大约不到对照区的一半。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

<正>1 ZHOU Q Z,FU P,LI S S,ZHANG C J,YU Q Y,QIU C Z,ZHANG H B,ZHANG Z.A comparison of co-expression networks in silk gland reveals the causes of silk yield increase during silkworm domestication. Front Genet,2020,11:225.DOI:10.3389/fgene.2020.00225题目家蚕与野蚕丝腺共表达网络的比较分析揭示了家蚕驯化过程中丝产量增加的原因摘要长期驯化和选择性育种使家蚕的产丝量是其野生祖先野桑蚕产丝量的几倍。然而,人们对驯化过程中蚕丝产量增加的分子机制知之甚少。根据家蚕和野蚕丝腺功能分化的动态模式,重庆大学ZHOU等发现在丝腺发育的早期和中期,家蚕中的表达上调基因主要涉及与细胞分裂和生长相关的DNA整合、核酸结合和转运蛋白活性,这导致家蚕的后部丝腺(PSG)细胞(丝蛋白合成"工厂")显著多于野蚕。在丝腺发育的后期,家蚕中的表达上调基因在蛋白质加工和核糖体途径富集,表明在家蚕驯化过程中蛋白质合成效率得到了提高。虽然家蚕丝腺中的丝素蛋白合成增加,但丝胶蛋白的产量也同时减少。这反映了家蚕和野蚕处于不同的选择压力下。重要的是,发现家蚕丝蛋白基因共表达的网络比野蚕的大。此外,在家蚕中与丝蛋白基因共表达的基因比在野蚕中更多地受到人工选择。研究结果表明,在家蚕驯化过程中,蚕丝产量的增加与生物系统的改善有关,该系统不仅包括蛋白质合成"工厂"(PSG细胞)的扩大,还包括丝蛋白基因和丝生产相关基因(如生物能量、运输和核糖体途径基因)的高表达。     

三眠蚕诱导剂SM-1对家蚕丝蛋白合成调控机理的研究——Ⅱ.SM-1对后部丝腺DNA合成速率和核酸含量的影响

本文探讨三眼蚕诱导剂SM一1对家蚕丝蛋白合成的调控机理.试验结果表明:(1)sM-1处理后,家蚕后部丝腺DNA中~3H-胸腺嘧啶核苷的参入速率明显增快.SM一1诱导三眠蚕在四龄第2天~3H-胸腺嘧啶核苷的参入量最高,比同时的对照高近1倍;五龄第2天SM—1处理区,在五龄第3天~H-胸腺嘧啶核苷的参入速率有所增快.(2)SM-1诱导的三眠蚕,后丝腺DNA和RNA含量的高峰比对照提前4-6天出现,且其末龄(四龄)DNA和RNA含量的增减趋势与对照末龄(五龄)DNV和RNA含量的增减趋势非常相似.(3)五龄前期用SM一1处理家蚕幼虫,对后丝腺DNA和RNA含量增加具有暂时的促进作用.     

家蚕（Bombyx mori）线粒体DNA的经济快速提取方法

对碱裂解法进行了改良,采用不同pH值的均浆缓冲液从家蚕5龄幼虫后部丝腺．蛹和卵中提取mtDNA,调查其得率和纯度,建立了家蚕线粒体DNA经济快速提取方法。     

蚕丝的生物合成(下)

4.有关丝蛋白合成的核酸 (1)核酸与茧丝量桑蚕丝物质的生成量与丝腺细胞内核酸含量有密切关系。“产丝能力高的品种,后部丝腺DNA含量远远高于产丝能力低的品种”,“大凡泌丝能力强者,则两类核酸(DNA和RNA)含量均较泌丝弱者为高”。“两类核酸在丝蛋白合成过程中,负有主要使命”(吕鸿声等,1964)。近十多年来,现代分子遗传学的发展进一步证实了上述论断。重松孟等(1973)调查了13个蚕品种后     

家蚕五龄后部丝腺蛋白质构成与茧层量的关系

家蚕 5龄期是后部丝腺细胞大量合成并分泌蚕丝主要成分丝素蛋白的时期 ,对这一时期后部丝腺细胞的蛋白质构成进行研究 ,有利于发现丝腺细胞分泌丝素蛋白有关的功能蛋白质 ,阐明蚕茧高产的机理。采用蛋白质双向电泳和图像分析技术 ,研究发现家蚕同一品种的不同个体 ,或同一个体不同部位的后部丝腺细胞蛋白质的构成基本一致。该结果反映了家蚕同一品种不同个体后部丝腺细胞的新陈代谢水平基本没有差异 ,家蚕品种个体间茧层量差异 ,可能是个体生长发育和后部丝腺细胞数的不同等原因造成 ,而与每一个体后部丝腺细胞的新陈代谢关系不显著。该结果也说明在目前双向电泳技术和染色技术的条件下进行家蚕后部丝腺蛋白质组研究时 ,从家蚕同一品种的任一个体、任一部位提取后部丝腺细胞的蛋白质样品 ,所得的蛋白质双向电泳结果基本相同     

家蚕后部丝腺细胞数与茧质性状关系的研究

采用OLYMPUS位相差显微镜(10×20)观察计数家蚕后部丝腺细胞数,结果得知:家蚕后部丝腺一侧细胞数在180—260个之间,标准差大多在5—25个之间;不同品种后部丝腺细胞数存在极明显差异;同一品种雌雄间差异不显著,其细胞数的分布属正态分布;同一头家蚕的两条后部丝腺的细胞数,少数个体存在一定的开差。后部丝腺细胞数与茧质性状的线性回归及离回归方差均达到极显著水平;后部丝腺细胞数杂种优势率与茧质件状杂种优势率大多没有显著的相关关系;说明后部丝腺细胞的多少是丝素蛋白产量高低的一个条件,而每个细胞合成、分泌丝素蛋白的能力强弱是产量高低的另一条件。     

保幼激素和蜕皮激素对家蚕离体后部丝腺吸收核酸和蛋白质标记前体的影响

用后部丝腺离体培养和示踪原子法,研究了保幼激素类似物和植源性蜕皮激素对家蚕后部丝腺吸收核酸和蛋白质标记前体的影响。离体后部丝腺对~3H-胸腺嘧啶核苷、~3H-尿嘧啶和~3H-甘氨酸的吸收活性均受培养液中激素的影响。在本试验培养时间内,总吸收量均以两种激素同时加入高于单种激素加入;在加入其中一种激素时,吸收活性还因供试幼虫发育时期的不同(五龄前期或后期)而表现出相反的趋势;吸收的~3H-甘氨酸参入后部丝腺蛋白质合成的比率,以加入保幼激素类似物时较低,加入蜕皮激素和两种激素同时加入时较高。因此认为,不同发育时期接受过不同内源激素作用了的后部丝腺,在短期的体外条件下对激素的反应是不同的;但五龄任何时期的后部丝腺,均是在两种激素共同作用下,比单种激素作用更有利于核酸和蛋白质的合成。     

家蚕品种P50和C108后部丝腺的表达序列标签及单核苷多态性比较

利用BLAST软件对家蚕品种P50和C108的4眠及5龄幼虫后部丝腺的表达序列标签(EST)进行比较,从分子水平证明了5龄期后部丝腺蛋白合成比4眠期更加活跃。运用S im4和D iffseq工具就EST比对结果进一步分析,在两个家蚕品种中共发现有1 584个单核苷酸多态(SNP),其中颠换型变异的SNP达820次,占51.77%,转换型变异的SNP达764次,占48.23%;发现有2 776个插入/缺失(InDel)变异,其中1 bp的InDel占了48.56%,小于27 bp的InDel达到了90%以上。研究结果从基因组水平上阐明了这两个家蚕品种间的多样性。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

保幼激素类似物对家蚕后部丝腺细胞核糖核酸组分含量动态的影响

家蚕后丝腺和脂肪体总RNA含量随着五龄期的增长而增加,在五龄中期达到最高水平.用Sepharose2B柱层析分离RNA各组分,观察到家蚕后丝腺rRNA,tRNA和mRNA的含量在五龄期的变化均与总RNA相对应.JHA ZR515处理家蚕后,后丝腺的RNA及其组分rRNA.tRNA和mRNA均明显增加.脂肪体RNA也有增加.这些结果显示出JHA增丝的原因可能与JHA在转录和翻译水平上促进了丝素蛋白基因的表达有关.     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

表达Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的转基因家蚕品系构建

家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。     

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

家蚕高蛋白血症模型建立及其丝腺细胞凋亡的特点研究

以阻止熟蚕吐丝的方法建立家蚕高蛋白血症模型,研究模型家蚕丝腺退化过程中细胞程序性死亡的特点,探索家蚕高蛋白血症模型的发病机制。形态解剖学观察显示,模型家蚕的丝腺退化过程延长了2倍时间;组织切片HE染色显示,模型家蚕的中部丝腺和后部丝腺都出现了退化启动推迟的现象。对家蚕组织解体退化信号通路相关基因表达水平的检测显示,模型家蚕丝腺细胞中自噬信号基因Atg6和Atg8的转录水平显著低于对照组家蚕,而凋亡信号基因Dronc的转录水平则显著高于对照组家蚕。免疫组化染色显示,模型家蚕丝腺细胞中凋亡启动蛋白Caspase-3在丝腺退化过程中持续表达。研究结果表明高蛋白血症模型家蚕丝腺细胞的凋亡活动增强,而丝腺退化延缓与自噬作用启动延迟有关。     

PI3K/AKT/TORC1信号通路对丝素蛋白合成转录因子SGF1表达的影响

SGF1(silk gland factor 1)是一种转录调控因子,属于Fox家族的Fox A亚家族成员,能够启动丝素基因的表达,合成丝素蛋白。已知果蝇和其他高等动物中的PI3K/AKT/TORC1信号通路可以调控Fox转录蛋白的表达。为了探究家蚕幼虫后部丝腺(PSG)中PI3K/AKT/TORC1信号通路对SGF1表达水平的影响,对4龄第4天和5龄第7天家蚕幼虫分别注射信号通路抑制剂Wort、Rapa和LY294,24 h后解剖取出后部丝腺,一组用于免疫组织化学染色实验,另一组用于提取蛋白质进行Western blot检测。免疫组织化学染色实验表明,与对照组相比,注射3种信号通路抑制剂的家蚕幼虫后部丝腺组织的绿色荧光亮度明显减弱;Western blot检测表明,与对照组相比,实验组家蚕幼虫后部丝腺的蛋白质浓度有所下降。综合以上结果初步得出PI3K/AKT/TORC1信号通路抑制剂处理均可降低家蚕幼虫后部丝腺中SGF1表达的结论,即提示可以通过上游信号通路PI3K/AKT/TORC1影响SGF1的表达水平,进而调控丝素蛋白的合成。     

添食不同含氮物质对家蚕产丝量及丝素蛋白基因表达的影响

给家蚕5龄幼虫分别添食大豆蛋白、NH4Cl和尿素后,调查家蚕产丝量的变化,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测蚕体丝腺组织中丝素重链基因(fib H)的表达变化,探究适合用于提高家蚕产丝量的含氮物质。5龄起蚕连续6 d按照0.45 mg/(头·d)的剂量添食尿素后,茧层率比对照组增加15.7%,且幼虫的体质量及丝腺体积都比对照组有所增加;5龄幼虫添食大豆蛋白和NH4Cl后茧层率无明显增加。qRT-PCR检测5龄起蚕按照上述剂量添食尿素120 h后,后部丝腺中fib H的表达量比对照组增加了1.5倍。上述结果再次证实了家蚕5龄幼虫添食尿素后可以增加产丝量,并且表明尿素可以促进蚕体后部丝腺中fib H基因的表达。     

H~3—标记昆虫保幼激素类似物对家蚕增丝机制之研究(简报)

1973年以来应用昆虫保幼激素类似物(IHA)养蚕获得稳定的增丝效果,IHA能提高家蚕消化液中胰蛋白酶及淀粉酶的活性,又能提高后部丝腺中DNA-P及RNAP的代谢,从而促进后部丝腺的谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性,为增加绢丝蛋     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。