苹果树腐烂病菌拮抗细菌筛选及鉴定

【目的】筛选对苹果树腐烂病菌具有较高抑菌活性的拮抗细菌,为苹果树腐烂病的生物防治提供理论依据.【方法】采用平板对峙法及生长速率法对分离自苹果树根际土壤和发病枝条的细菌进行筛选,并根据形态学与分子生物学对抑菌活性较高的菌株进行鉴定.【结果】共分离出13株细菌,其中QYTR-2对苹果树腐烂病菌的抑菌率最高,为82%,明显高于其他菌株.菌株QYTR-2不同稀释倍数的发酵滤液对苹果树腐烂病菌均有一定的抑制作用,其中5倍发酵滤液抑菌率最高,达92.23%.结合形态学和分子生物学技术鉴定该菌为嗜麦芽寡氧单胞菌Stenotrophomonas maltophilia.【结论】拮抗细菌QYTR-2(Stenotrophomonas maltophilia)对苹果树腐烂病菌具有良好的抑制作用,研究结果对丰富苹果树腐烂病的生防资源和开发利用生防菌株具有指导意义.     

不同碳氮源对苹果树腐烂病菌胞外果胶酶活性的影响

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳氮源。用不同含量的最佳碳、氮源与MS培养基培养03-8菌株,10d时取样,测定胞外果胶酶活性,确定培养基中最佳碳、氮源的含量。【结果】在MS培养基中发酵10d,苹果树腐烂病菌致病力增强突变体(X907)产生的胞外果胶酶活性最高,致病力丧失突变体(T1)产生的酶活性最低。用可溶性淀粉、果胶为碳源培养野生型菌株03-8,在第10天培养滤液中果胶酶活性均高于其他供试碳源;以可溶性淀粉为碳源,其含量为0.5%时培养滤液中果胶酶活性最高。在5种供试氮源中,以0.25%蛋白胨为氮源发酵10d产生的胞外果胶酶活性最高。【结论】3种苹果树腐烂病菌发酵10d产生的胞外果胶酶的活性与其致病力相关;含0.50%可溶性淀粉和0.25%蛋白胨的MS培养基为苹果树腐烂病菌产酶的最佳培养基,发酵10d培养滤液中果胶酶的活性最高。     

苹果树主要病害内生拮抗真菌的筛选及拮抗特性

【目的】筛选苹果树腐烂病菌Valsa malimiyabe与苹果树炭疽病菌Glomeralla cingalata的内生拮抗真菌,并研究其抑菌效果。【方法】分离发病地区健康苹果树的根、茎及其根际土壤中的拮抗内生真菌,室内抑菌试验测定其对苹果树腐烂病菌和苹果树炭疽病菌的抑制作用;发酵培养试验检测其内生真菌中抑菌物质的耐热性。【结果】分离到的18株内生真菌分属3个属,其中茎分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验表明,对苹果树腐烂病菌和炭疽病菌的抑菌率高于60%的有8株,其中菌株J2、J16、J17对苹果树腐烂病的抑制率分别为82.75%、84.31%和82.35%,菌株T1对苹果树菌株炭疽病的抑制率为80.67%。拮抗真菌J2、J16、J17、J24、T1发酵液对2种病原菌分生孢子萌发的抑制率均不小于39.55%,最高达69.75%;在121℃时,J11和T1无菌滤液的热稳定性较好,而J2无菌滤液在100°C时就失去了生物活性。【结论】拮抗真菌J2、J11、J16、J17、T1均对苹果树腐烂病菌及苹果树炭疽病菌有较强拮抗作用,可为开展这2种病害的生物防治研究提供潜在资源。     

核桃内生菌HT-6发酵滤液的抑菌作用研究

为了明确核桃内生菌HT-6菌株对植物病原菌的抑菌活性,采用菌落直径生长法和悬滴法测定了发酵滤液对植物病原菌菌丝和孢子萌发的抑制作用。结果表明,发酵滤液对供试的5种病原真菌均有较强的抑菌活性;其中,对辣椒炭疽病菌的抑菌效果最强,EC50为35.1μL/m L,对番茄灰霉病菌的抑菌效果相对较弱,EC50为115μL/m L;发酵滤液浓度为200μL/m L时对辣椒炭疽病菌、核桃枯梢病菌、苹果树腐烂病菌的抑菌率都在80%以上;浓度为200μL/m L时对梨黑斑病菌的孢子萌发抑制率就达到了100%,500μL/m L时对番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、梨黑斑病菌这3种病原菌的孢子萌发抑制率都达到或接近100%。因此,HT-6菌株在植物病害的生物防治方面具有很大潜力和价值,值得进一步开发研究。     

苹果树主要病害内生拮抗真菌的筛选及拮抗特性

为了筛选出苹果树腐烂病菌及苹果树炭疽病菌的内生拮抗真菌,并研究出相关的抑菌效果。采用分离发病地区健康苹果树的根、茎及其根系土壤中的拮抗内生真菌,在室内抑菌实验测定其对苹果树腐烂病菌和苹果树炭疽病菌的抑制作用的方法。实验证明发酵液对苹果树2种病菌的抑菌率比较高,无菌滤液的热稳定性比较好,但是无菌滤液在100℃左右会失去生物活性。拮抗真菌对于苹果树腐烂病菌及苹果树炭疽病菌有着较强的拮抗作用,其能够有效地预防相关疾病。     

苹果树皮内生菌对苹果树腐烂病的防治效果

从苹果树皮中分离出1株对苹果腐烂病病菌具有较好拮抗作用的内生细菌——B5014。该菌株对腐烂病病菌的抑菌率达55.59%,显著高于其他菌株;通过对菌株B5014发酵滤液进行不同浓度稀释后发现,随着浓度的不断降低,菌株B5014发酵滤液对腐烂病病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制率不断下降;田间试验表明,在接种时间较短(10 d)时,B5014细菌悬浮液原液处理可以与生产中常规使用的80%代森锰锌800倍液防效基本持平,但到接种20 d时,防效低于常规化学防治方法。     

苹果树腐烂病菌挥发性代谢产物的分离提取与致病性研究

为了研究苹果树腐烂病菌的致病活性物质,本研究利用MS液体培养基培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法用乙酸乙酯作溶剂,收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,用苹果枝条进行致病活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生的2种挥发性物质的结构分别为异戊醇和2-苯乙醇,这2种物质均对苹果树枝具有致病活性。     

土壤拮抗细菌的分离与抗植物病原真菌活性初步研究

为了分离筛选出土壤中对植物病原真菌具有拮抗作用的细菌,以4种土传病害病原菌为诱导菌株,采用土壤颗粒撒布法,从不同生态区农田土壤样本中分离得到55株拮抗细菌菌株。测定了部分拮抗菌株及发酵滤液对植物病原菌的拮抗作用。结果表明:分离获得的细菌菌株对病原真菌均表现出一定程度的抑制作用,其中对菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌丝抑制率达60%以上的拮抗菌株,分别有1、12和8株。9株拮抗菌发酵滤液对大豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)和马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)6种植物病原菌表现出较高的抑菌效果,其中YS7菌株发酵产物对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、水稻恶苗病菌均表现较强的抑菌活性,对玉米大斑病菌抑菌圈直径最大达到了56.2mm。从抗菌谱上看,27株拮抗菌株代谢产物对4种以上的拮抗对象表现有抑菌活性,表明拮抗菌株代谢产物具有较为广谱的抑菌效果。     

苹果树腐烂病菌挥发性代谢物及其毒素活性

研究苹果树腐烂病菌代谢产生的挥发性物质及其毒素活性。通过在树皮培养基中培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,并利用苹果枝条对其标准物质进行毒素活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生5种挥发性物质,分别为2-氟丙烯、异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚,其中异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚均对苹果树枝具有毒素活性。苹果树腐烂病菌产生的挥发性代谢产物对苹果树具有毒素活性,为苹果树腐烂病菌致病机理的探索提供新的思路与方向。     

发光杆菌Photorhabdus sp. HBgy13菌株对4种蔬菜病原菌的抑菌活性

测定了发光杆菌属Photorhabdus sp. HBgy13菌株对番茄菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum), 冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、萝卜褐腐病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)等4种蔬菜病原真菌的抑制作用,并对该菌株发酵液中抑菌活性成分的理化特性及滤液活性进行了研究.结果表明该菌株对黄瓜灰霉病菌和萝卜褐腐病菌有较好的抑制作用;该菌株在200 r/min,28℃,96 h发酵后,抑菌活性达到最大,抑菌圈分别达到2.28 cm和2.74 cm;发酵液经50℃处理10 min后,对黄瓜灰霉病菌和萝卜褐腐病菌抑制活性分别下降34.2%、43.7%,经80 ℃处理10 min后,对这2种病菌的抑菌活性消失,说明发酵液中的抑菌活性成分不耐高温;发酵液经紫外线处理30 min后抑菌活性完全消失;发酵液pH值为7时,抑菌活性最强.滤液对黄瓜灰霉病菌和萝卜褐腐病菌的抑制活性分别为原液的33.0%和33.2%.     

基于MaxEnt模型预测苹果树腐烂病在中国的潜在地理分布

为了明确影响苹果树腐烂病发生的主要环境因子及其潜在地理区域,根据1960年至1990年30 a环境气候因子数据,利用19个生物气候因子首先建立MaxEnt模型,结果显示该模型的准确性良好,训练数据AUC值达0.884,影响MaxEnt模型最重要的影响因子是最暖季度平均温(Bio10),其对模型构建的贡献率为22.3%,其次是最冷季度降水量(Bio19)和最干月份降水量(Bio14)。随后,该模型结合以往苹果树腐烂病发生地点统计数据,对影响苹果腐烂病发生的环境因子和适生区进行预测。结果表明最冷月份最低温(Bio6)、最暖季度平均温(Bio10)和最冷季度降水量(Bio19)是影响苹果树腐烂病分布的主要环境因子。     

苹果树腐烂病菌发酵液中根皮苷主要降解成分的分析

【目的】明确苹果树腐烂病菌致病过程中对降解根皮苷发挥主要作用的物质,为揭示该病原菌的致病机理提供理论依据。【方法】以根皮苷为碳源发酵培养苹果树腐烂病菌10 d后,测量菌丝干质量及病原菌对根皮苷的降解率;以淀粉为碳源获取病原菌30 d的无菌发酵液,进一步分离发酵液中的有机酸和蛋白类物质。用HPLC法分别检测病原菌、淀粉无菌发酵液、有机酸类、蛋白类物质及发酵剩余液对根皮苷的降解作用。【结果】以根皮苷为碳源发酵培养病原菌10 d后,每100 mL发酵液中菌丝干质量为48 mg,病原菌对根皮苷的降解率为92.46%,发酵液对根皮苷的降解率为99.88%。1 mg/mL蛋白类物质与根皮苷作用5 d的降解率为90.4%,有机酸类对根皮苷的降解率仅为1.6%,发酵剩余液对根皮苷的降解率为5.9%。根皮苷的降解率随蛋白液质量浓度的增加和作用时间的延长而升高。【结论】在根皮苷降解过程中起主要作用的物质为苹果树腐烂病菌代谢产生的蛋白,其可能为细胞壁降解酶类。     

解淀粉芽孢杆菌F11抗真菌活性研究

解淀粉芽孢杆菌F11对核盘病菌、玉米大斑病菌、猕猴桃软腐病菌、烟草炭疽病菌等12种作物病原菌具有高效、广谱的抑菌效果,研究其生物防治机理可为该菌株应用于植物病害防治提供理论依据。本研究采用混菌法、牛津杯法及显微镜观察法探究了菌株F11发酵液不同稀释倍数、发酵液3种分离液（菌株发酵液离心分离获得上清液A,上清液A继而进行酸沉淀和甲醇提取分别获得发酵上清液B和胞外代谢物粗提液）对病原菌的抑制效果及抑菌特性。混菌法结果表明,菌株F11的抑菌效果随稀释倍数的增加而逐渐下降,但1 000倍稀释液对樟树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的相对抑制率和10倍稀释液与发酵原液对烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、核盘病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、猕猴桃软腐病菌（Botryosphaeria dothidea）的相对抑制率均达100%,且所列稀释液与发酵原液间无显著差异。牛津杯法结果表明,上清液B中不含抑菌活性物质,而上清液A与胞外代谢物粗提液中均含有抑菌活性物质。显微镜观察结果显示,胞外代谢物粗提液中的抑菌活性物质可使病原菌菌丝消融、断裂、扭曲、缠绕变形、原生质体凝集渗漏、形成泡囊结构等。研究表明,菌株F11病原菌的抑菌效果随发酵液稀释倍数增加而下降,其对樟树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的防治效果最好,发酵液经1 000倍稀释后相对抑制率仍达100%;对烟草黑胫病菌、核盘病菌、玉米大斑病菌、猕猴桃软腐病菌四种病原菌则可采用10倍稀释液代替发酵原液进行防治。其抑菌活性物质存在于胞外代谢物粗提液中,该物质的抑菌特性和脂肽抗生素的作用基本一致,推测为一类脂肽抗生素。     

多孢木霉HZ-31菌株活性物质的初步分离及除草活性研究

为明确多孢木霉HZ-31菌株的除草活性物质,对其活性成分进行逐步分离。采用种子萌发法和离体叶片接种法分离最佳活性组分。结果表明,HZ-31菌株发酵滤液活性高于发酵液,发酵滤液对野燕麦和油菜种子萌发抑制率分别为80.00%和91.67%。4种有机溶剂萃取物对7种杂草叶片的致病效果由强到弱表现为:正丁醇相乙酸乙酯相石油醚相氯仿相。4种有机溶剂萃取粗提物在5 mg/mL浓度下对野燕麦和油菜的种子萌发均有强烈的抑制作用,除乙酸乙酯外,其余处理的发芽抑制率为100%。3 mg/mL浓度下正丁醇粗提取物能完全抑制野燕麦和油菜种子的萌发。因此,粗提物活性测定以离体叶片和种子萌发结果为依据,检测HZ-31菌株活性物质最佳有机相,最终确定最佳活性组分在正丁醇相中。     

北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选

为明确导致北苍术根腐病的病原菌,本实验从承德市感病北苍术块茎中分离病原微生物,并对病原微生物致病性进行回接验证。研究分离获得的具有致病性的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。从健康药用植物根际土壤中分离获得94株根际微生物,通过平板拮抗筛选获得2株生防菌,分别为菌株SFJ-27和菌株SFJ-41,平板对峙实验结果表明2株生防菌抑菌率均在50%以上。通过分子生物学和形态学鉴定2株菌分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）。盆栽实验结果表明,菌株SFJ-27与菌株SFJ-41对北苍术根腐病具有明显的生防效果,防治效果分别为52.27%和68.19%。研究表明,尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）可以导致北苍术根腐病的发生,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对北苍术根腐病具有防治作用。     

近缘毛壳Chaetomium subaffine LB-1抑菌物质存在部位及提取方法

【目的】对近缘毛壳Chaetomium subaffine菌株LB-1产生抑菌物质的部位及提取方法进行研究,为开发生防菌株LB-1防治植物病害奠定基础。【方法】以番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和玉米大斑病菌Exserohilum turcicum为指示菌,采用平板密封培养法检测菌株LB-1是否产生挥发性抑菌物质;采用菌体超声破碎和液态培养的方式检测菌株LB-1产生的非挥发性抑菌物质存在的部位;采用含毒培养基法和滤纸片法检测菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀、盐酸沉淀和有机溶剂萃取物的抑菌效果,以确定菌株LB-1培养液中抑菌物质的提取方法。【结果】菌株LB-1与2种供试病原菌密封共培养时,对病原菌的生长没有明显影响,表明菌株LB-1不能产生挥发性抑菌物质。菌株LB-1菌体胞内提取物的抑菌活性与对照无差异,但其培养液对B. cinerea和E. turcicum的生长有较强的抑制作用,表明菌株LB-1产生的抑菌物质存在于菌体细胞外。菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀和盐酸沉淀对2种供试植物病原真菌的生长均无抑制效果,但有机溶剂萃取可获得菌株LB-1培养液中的抑菌物质,其中正丁醇萃取物...     

番茄灰霉生防菌XF的筛选、鉴定及生防因子的初步探索

菌株XF是一株分离自甘肃省兴隆山原始森林土壤的对番茄灰霉病具有良好防治效果的拮抗细菌。通过对该菌株的形态学特征观察以及16S rDNA序列的分析鉴定,确定菌株XF为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。拮抗试验表明,菌株XF能显著抑制番茄灰霉菌菌丝的生长,抑制率可达66.35%,并使菌丝出现异常分枝,囊泡状畸形且伴有细胞壁破裂,内涵质外泄的现象。菌株XF发酵60 h,10%无菌滤液对番茄灰霉菌菌丝的抑制率为98.19%。生化分析测定结果表明,菌株XF的次生代谢物含有蛋白酶、葡聚糖酶、几丁质酶、铁载体以及生长素IAA,表明该菌株具有生物防治潜力。     

50%戊唑醇纳米可溶性粉剂对苹果斑点落叶病菌活性及田间防效的影响

采用菌丝生长速率法,测定50%戊唑醇纳米可溶性粉剂对苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata f.sp.mali)的室内毒力,并在2013年进行2个不同试验地的田间药效试验。室内毒力测定结果表明,50%戊唑醇纳米可溶性粉剂对苹果斑点落叶病菌具有很好的抑制效果,其EC50值为6.53mg/L。田间试验结果表明,50%戊唑醇纳米可溶性粉剂对苹果斑点落叶病有显著的防治效果,用质量浓度125mg/L处理苹果植株,在春梢和秋梢停止抽生期防效达90%左右。供试药剂对苹果树生长发育无不良影响,使用安全。     

生防菌长枝木霉菌株T6及其代谢产物对立枯丝核菌拮抗作用

为了开发对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）具有较好拮抗作用的生防制剂,采用对峙培养法、含药培养基法和显微观察法,测定生防菌长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum）菌株T6及其代谢产物对立枯丝核菌的抑制作用活性,初步探究长枝木霉菌株T6的作用机制。结果表明,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌生长具有显著的抑制作用,对峙培养5 d时菌株T6不仅对立枯丝核菌营养生长抑制率为66.50%,而且对其菌丝具有明显重寄生作用。菌株T6发酵液及其代谢产物对立枯丝核菌营养生长也具有显著的抑制效果,培养4 d时其对立枯丝核菌的生长抑制率分别为72.29%和71.91%。因此,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌具有显著的拮抗作用,主要通过对病原菌的重寄生作用及其代谢产物发挥拮抗作用。