枯草芽孢杆菌CCTCC M207209对苹果采后致腐真菌的抑制作用

【目的】探讨枯草芽孢杆菌CCTCC M207209液体培养物和固体培养中的挥发性气体产物对多种苹果致腐真菌的抑菌活性,初步确定发酵液中抑制扩展青霉的活性物质的特性,为其在生物防治中的应用提供理论依据。【方法】以扩展青霉、圆弧青霉、皮落青霉、矮棒曲霉、黑曲霉、黄柄曲霉为指示菌,用对峙培养法检测菌体的抑菌活性,用杯碟法检测无菌体发酵液及其提取物的抑菌活性,用平板对扣法测定挥发性气体产物的抑菌活性,以确定枯草芽孢杆菌CCTCC M207209的各种培养物对苹果采后致腐真菌的抑制作用。【结果】枯草芽孢杆菌CCTCCM207209的菌体、无菌体发酵液和挥发性气体产物对多种苹果致腐真菌,特别是扩展青霉有显著抑制作用,其中菌体和无菌体发酵液的抑菌圈直径分别为(19.0±0.82)mm和(18.9±0.57)mm,挥发性气体产物对扩展青霉的抑菌率可以达到(87.2±4.19)%;发酵液中抑制扩展青霉的活性物质能够溶于50%体积分数乙醚;发酵液经50%硫酸铵饱和度提取后,抑菌活性保持率为84.4%。【结论】枯草芽孢杆菌CCTCC M207209的发酵液和挥发性气体产物能够抑制多种苹果致腐真菌,特别是扩展青霉的生长。     

柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究

【目的】筛选鉴定柑橘溃疡病菌拮抗菌,研究其培养特性及拮抗物质的初步性质,为柑橘溃疡病的生物制剂研制奠定基础。【方法】利用对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌具有良好抑制作用的生防菌,并通过对菌株形态、生理生化特征以及16SrDNA序列分析鉴定其分类地位;以单因素试验和正交设计方法对影响CQBS03菌株抑菌活性物质产生的各种培养条件进行优化;利用硫酸铵沉淀获得抑菌物质粗提物并测定其对温度、蛋白酶及氯仿的敏感性。【结果】经鉴定CQBS03为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。CQBS03抑菌活性成分主要存在于培养液中,能被80％饱和度硫酸铵沉淀,最高可耐受的温度范围为60-70℃;活性成分在280nm处有最大吸收峰,分子量大于10kD,对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定,而对氯仿部分敏感。培养特性研究表明,CQBS03最适培养基为YPG液体培养基,抑菌物质产生的最适培养条件为：pH8．0左右,28℃培养72h。【结论】枯草芽孢杆菌CQBS03所产生的抑菌物质主要成分是蛋白质,且属于外泌型蛋白;该抑菌蛋白对多种植物病原菌有抑菌作用,尤其对柑橘溃疡病菌抑菌活性高,稳定性好,是一株极具开发潜力的生防菌株。     

拮抗细菌EBS05生长曲线及粗提物抑菌活性测定

为探明枯草芽孢杆菌EBS05的生长曲线及其菌液粗提物的抑菌活性,特开展本试验。通过测定D600值,初步构建EBS05的生长曲线;并分别采用盐酸和40%硫酸铵对发酵液中的抑菌物质进行沉淀粗提;用对峙培养法测定了粗提物的抑菌活性,用生长效率法测定了EBS05粗提取物对黄瓜灰霉菌、西瓜炭疽菌、黄瓜枯萎菌、小麦赤霉菌和小麦纹枯菌的抑菌活性。结果表明,在NYD培养液中培养72 h后,EBS05菌体数量最大,此时抑菌活性也最强;用0.1 mol·L-1盐酸调节菌液p H至2.0,或用40%硫酸铵都能够有效沉淀出发酵液中的抑菌物质,且沉淀抑菌活性与发酵原液相当;EBS05粗提物对12种植物病原菌均具有一定的抑菌活性。总体来看,枯草芽孢杆菌EBS05是一种很有发展前景的生防微生物资源。     

柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究

 【目的】筛选鉴定柑橘溃疡病菌拮抗菌,研究其培养特性及拮抗物质的初步性质,为柑橘溃疡病的生物制剂研制奠定基础。【方法】利用对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌具有良好抑制作用的生防菌,并通过对菌株形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析鉴定其分类地位;以单因素试验和正交设计方法对影响CQBS03菌株抑菌活性物质产生的各种培养条件进行优化;利用硫酸铵沉淀获得抑菌物质粗提物并测定其对温度、蛋白酶及氯仿的敏感性。【结果】经鉴定CQBS03为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。CQBS03抑菌活性成分主要存在于培养液中,能被80%饱和度硫酸铵沉淀,最高可耐受的温度范围为60～70℃;活性成分在280 nm 处有最大吸收峰,分子量大于10 kD,对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定,而对氯仿部分敏感。培养特性研究表明,CQBS03最适培养基为YPG液体培养基,抑菌物质产生的最适培养条件为：pH 8.0左右,28℃培养72 h。【结论】枯草芽孢杆菌CQBS03所产生的抑菌物质主要成分是蛋白质,且属于外泌型蛋白;该抑菌蛋白对多种植物病原菌有抑菌作用,尤其对柑橘溃疡病菌抑菌活性高,稳定性好,是一株极具开发潜力的生防菌株。     

甘草内生菌Z4菌株的分批发酵动力学研究

【目的】对陕北野生甘草的内生菌Z4菌株进行分批发酵,研究并建立其菌体生长、抑菌物质生成及基质消耗的动力学模型。【方法】采用分批发酵法,每12h测1次Z4菌株在发酵过程中的菌体生长、抑菌物质生成及基质消耗的试验值,共测15次;基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,建立Z4菌株分批发酵的动力学模型;利用DPS软件求解模型参数,并对模型拟合效果进行验证。【结果】Z4菌株菌体生长模型的拟合效果较好,抑菌物质生成的模拟值于发酵后期略高于试验值,基质消耗的模拟值与试验值在发酵前期有小的偏差,但均基本反映了Z4菌株分批发酵过程的动力学特征。【结论】甘草内生菌Z4菌株分批发酵中菌体生长与抑菌物质生成的关系属于生长偶联型,有直接的相关性。     

枯草芽孢杆菌菌株Czk1挥发性物质的 抑菌活性及其组分分析

【目的】明确橡胶树内生枯草芽孢杆菌菌株Czk1挥发性物质的抑菌活性及其组分,为橡胶树病害的生物防治提供参考。【方法】以橡胶树红根病菌GP010为指示菌,分别以5种不同培养基LB、TSB-YE、TSB、NB和PDA为营养来源,利用双皿对扣法和菌丝生长速率法评定不同营养条件下Czk1挥发性物质对病原菌的作用活性强弱,筛选产抑菌挥发性物质的最优培养基;通过双皿对扣法测定Czk1挥发性物质对橡胶树5种根病菌(红根病菌、褐根病菌、白根病菌、紫根病菌和臭根病菌)和橡胶树炭疽病菌的抑菌活性,并利用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱法(HSSPME-GC-MS)鉴定Czk1的挥发性物质组分。【结果】在LB培养基中,Czk1在不同浓度下的抑菌活性均优于其他培养基,是Czk1产抑菌挥发性物质的最优培养基。Czk1挥发性物质对6种参试病原菌均表现出良好的抑制作用,Czk1菌液浓度为105CFU/mL时抑制率均在50.00%以上,Czk1菌液浓度为108CFU/mL时抑制率在90.00%以上;Czk1挥发性物质可抑制紫根病菌、炭疽病菌和臭根病菌色素的产生,促进褐根病菌产生色素,并导致紫根病菌、褐根病菌和炭疽病菌菌丝生长畸形;其对橡胶树炭疽病菌孢子萌发抑制率为71.30%;其在土壤中对橡胶树红根病菌和褐根病菌仍具有较好的抑菌效果,抑制率分别为63.37%和54.57%。利用HS-SPME-GC-MS对Czk1所产挥发性物质组分进行分析,共分离鉴定获得包括碳氢化合物、胺类、醇类、烯类、酚类、酯类、吡嗪类、醛类、酮类及其他类等33种挥发性物质。【结论】Czk1所产挥发性物质可作为生防资源应用于橡胶树病害防治。     

中度嗜盐菌S61生防因子分析及其对马铃薯干腐病的防效

【目的】测定中度嗜盐菌S61对马铃薯干腐病病原菌的抑菌活性及对干腐病的防效，为马铃薯干腐病的生物防治及绿色防控提供科学依据。【方法】以来源于青海察尔汗盐湖的1株中度嗜盐菌S61为材料，采用形态学、生理生化特征及分子生物学方法对菌株S61进行鉴定。通过对峙培养法和马铃薯活体试验，进行菌株S61及其发酵液有机溶剂萃取物抑制马铃薯干腐病病原菌活性测定及对储藏期马铃薯安全性评价。采用平板透明圈法和排油圈法，分别测定菌株S61发酵液分泌抑菌蛋白和产生脂肽类物质的能力。【结果】结合菌株S61的形态特征、生理生化特征和系统发育进化树分析结果，将菌株S61鉴定为特氏盐芽孢杆菌（Halobacillus trueperi）。其发酵液能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，并能产生脂肽类物质。菌株S61及其有机溶剂萃取物对3株马铃薯干腐病病原菌（青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6）均有不同程度的抑菌活性，其中对青9A-4-13的抑菌活性最强，对峙培养7 d后的抑制率为55.67%。菌株S61发酵液不同浓度（1、5、10和20 mg/mL）正丁醇萃取物对青9A-4-13的抑菌活性最高，抑制率分别为61.50%、63.00%、64.00%和66.00%。菌株S61发酵液及其正丁醇萃取物对马铃薯储藏安全。【结论】中度嗜盐菌S61在体外和马铃薯活体上均对干腐病病原真菌具有抑制作用，其发酵产物的正丁醇萃取物活性最高，并存在生防因子，能产生一些具有抑菌活性的次级代谢产物，具有较好的马铃薯干腐病生物防治潜力。     

枯草芽孢杆菌BAB-1脂肽类化合物的分离及稳定性分析

枯草芽孢杆菌菌株BAB-1是一株高效防治番茄灰霉病的生防细菌。通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从该菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物。该物质能够显著抑制番茄灰霉菌菌丝生长及分生孢子的萌发,孢子萌发抑制率为83.02%。抑菌谱试验表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该抑菌物质对热稳定,能耐受较广的pH范围,对多种蛋白酶不敏感,在几种常用有机溶剂中保持抑菌活性基本不变。结果表明枯草芽孢杆菌菌株BAB-1产生的脂肽类物质性质稳定,具有较强的抑菌作用。     

枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定

【目的】对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株BAB-1产生的脂肽类物质和挥发性物质进行分离鉴定和抑菌活性研究。【方法】采用HPLC和MALDI-TOF-MS对脂肽类物质进行分离纯化和鉴定;采用GC-MS对挥发性物质进行鉴定。【结果】HPLC分析表明,菌株BAB-1产生的脂肽类物质由LP-1、LP-2、LP-3三类组分组成,其中LP-2起主要抑菌作用。MALDI-TOF-MS质谱分析表明,LP-1为surfactin(C13—C15),LP-2为fengycin A(C14—C15)和fengycin B(C14—C18),LP-3成分未能确定。GC-MS结果表明,菌株BAB-1产生的挥发性物质由多种成分组成,主要为醇类、酮类、酸类、胺类和烷烃类等。【结论】枯草芽孢杆菌菌株BAB-1能够产生脂肽类物质和挥发性物质,并且这两类物质都具有较强的抑菌活性。     

香蕉枯萎病内生生防菌H4-3抑菌蛋白提取及抑菌活性研究

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa H4-3菌株是福建省农科院农业生物资源研究所微生物研究中心从香蕉植株中分离到的一株内生菌,该菌株对香蕉枯萎病病原菌具有很强的抑菌活性,初步判断其活性物质为大分子蛋白.采用硫酸铵沉淀方法提取H4-3菌株的抑菌蛋白,研究不同硫酸铵浓度对H4-3菌株抑菌活性的影响,结果表明：随着硫酸铵浓度的提高,H4-3菌株抑菌蛋白粗提液的抑菌活性逐步提高,其盐析后的上清液抑菌活性则逐步降低,70％饱和度的硫酸铵处理即可完全沉淀.     

多孢木霉HZ-31菌株活性物质的初步分离及除草活性研究

为明确多孢木霉HZ-31菌株的除草活性物质,对其活性成分进行逐步分离。采用种子萌发法和离体叶片接种法分离最佳活性组分。结果表明,HZ-31菌株发酵滤液活性高于发酵液,发酵滤液对野燕麦和油菜种子萌发抑制率分别为80.00%和91.67%。4种有机溶剂萃取物对7种杂草叶片的致病效果由强到弱表现为:正丁醇相乙酸乙酯相石油醚相氯仿相。4种有机溶剂萃取粗提物在5 mg/mL浓度下对野燕麦和油菜的种子萌发均有强烈的抑制作用,除乙酸乙酯外,其余处理的发芽抑制率为100%。3 mg/mL浓度下正丁醇粗提取物能完全抑制野燕麦和油菜种子的萌发。因此,粗提物活性测定以离体叶片和种子萌发结果为依据,检测HZ-31菌株活性物质最佳有机相,最终确定最佳活性组分在正丁醇相中。     

解淀粉芽孢杆菌F11抗真菌活性研究

解淀粉芽孢杆菌F11对核盘病菌、玉米大斑病菌、猕猴桃软腐病菌、烟草炭疽病菌等12种作物病原菌具有高效、广谱的抑菌效果,研究其生物防治机理可为该菌株应用于植物病害防治提供理论依据。本研究采用混菌法、牛津杯法及显微镜观察法探究了菌株F11发酵液不同稀释倍数、发酵液3种分离液（菌株发酵液离心分离获得上清液A,上清液A继而进行酸沉淀和甲醇提取分别获得发酵上清液B和胞外代谢物粗提液）对病原菌的抑制效果及抑菌特性。混菌法结果表明,菌株F11的抑菌效果随稀释倍数的增加而逐渐下降,但1 000倍稀释液对樟树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的相对抑制率和10倍稀释液与发酵原液对烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、核盘病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、猕猴桃软腐病菌（Botryosphaeria dothidea）的相对抑制率均达100%,且所列稀释液与发酵原液间无显著差异。牛津杯法结果表明,上清液B中不含抑菌活性物质,而上清液A与胞外代谢物粗提液中均含有抑菌活性物质。显微镜观察结果显示,胞外代谢物粗提液中的抑菌活性物质可使病原菌菌丝消融、断裂、扭曲、缠绕变形、原生质体凝集渗漏、形成泡囊结构等。研究表明,菌株F11病原菌的抑菌效果随发酵液稀释倍数增加而下降,其对樟树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的防治效果最好,发酵液经1 000倍稀释后相对抑制率仍达100%;对烟草黑胫病菌、核盘病菌、玉米大斑病菌、猕猴桃软腐病菌四种病原菌则可采用10倍稀释液代替发酵原液进行防治。其抑菌活性物质存在于胞外代谢物粗提液中,该物质的抑菌特性和脂肽抗生素的作用基本一致,推测为一类脂肽抗生素。     

32种植物提取物的离体抑菌活性测定

用琼胶平板法和悬滴法,测试了32种植物丙酮提取物对小麦赤霉病菌(FusariumgraminerumSchw)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata(Stonem)Schr.etSpauid)、辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeon.)、番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)和玉米大斑病菌(ExserohilumturcicumPass.)等5种病原真菌的离体抑制活性。结果表明,在供试质量浓度为干样0.1g/mL时,对2种或2种以上供试菌种菌丝生长的抑制作用达60%以上的植物样品有铁杆蒿(叶)、蒙古蒿(茎叶)、小白酒草(叶)、紫苞风毛菊、牛蒡、太白山蟹甲草和苦参(根)等7种,其中紫苞风毛菊和苦参(根)对4种供试病菌的菌丝生长有明显的抑制作用,蒙古蒿(茎叶)对小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌孢子萌发有较高的抑制活性,值得进一步研究。     

恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌活性及抑菌物质合成相关基因表达的影响

为明确恒定pH对Xenorhabdus nematophila YL001抑菌物质产生及相关抑菌物质合成的影响,对pH 5.5、pH 7.0及pH 8.5培养条件下X.nematophila YL001的抑菌活性、主要抑菌物质[Xenocoumacin1(XCN1)和Nematophin]的代谢差异及主要抑菌物质的生物合成基因与相关转录调节子基因的表达量进行分析。结果表明,X.nematophila YL001发酵液对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 7.0时最佳,而其胞外产物乙酸乙酯与甲醇提取物对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑菌作用在pH 8.5时最佳;LC-MS分析表明,随pH的升高,活性物质xcn1的相对含量逐渐升高,而Nematophin的相对含量则先升高后下降;qRT-PCR分析表明,不同恒定pH下,X.nematophila YL001主要抑菌物质生物合成基因及相关转录调节子基因的表达量存在显著差异。pH可显著影响X.nematophila YL001菌株的抑菌活性及代谢,且碱性条件更利于活性物质的产生并保持稳定性。     

一株烟草肠杆菌（Enterobacter tabaci）S4菌株的鉴定及其效果测定

为筛选出一株具有微生物源植物调节剂功能的细菌,并探讨其潜在的生物功能,利用平板涂布法以及16S rRNA鉴定技术对菌株进行分离、鉴定;同时使用该菌株发酵液对番茄的种子和幼苗分别进行浸种和灌根处理,并进行农艺指标测定。结果表明：经鉴定该菌株为烟草肠杆菌,其发酵液对番茄种子的萌发、幼苗的生长具有显著的促进作用;发酵液浓度为1×10⁴ cfu·mL^-1时促生效果最好,与对照相比,根长、株高、干质量和鲜质量分别增加63.42%、46.17%、150.00%和144.83%。研究结果可为该菌株开发为微生物肥料或微生物源植物生长调节剂提供技术支持。     

链霉菌S417菌株发酵液的抗真菌活性及稳定性研究

以16种植物病原真菌为供试菌,采用菌丝生长速率法测定拮抗链霉菌S417发酵液的抑菌谱;以采后香蕉炭疽病菌为指示菌,管碟法测定发酵液经不同理化园子处理后的抑菌活性.结果显示:链霉菌S417发酵液对16种植物病原真菌均具有不同程度的抑菌活性,其中对香蕉炭疽病菌、玉米大斑病菌等5种真菌的抑制率在82.53％～69.63％之间,显著高于其他供试菌株.120℃处理20 min,发酵液仍有较强抑菌活性;紫外线照射25 min,对发酵液抑菌活性无显著影响;阳光照射4h,抑菌活性丧失;发酵液对酸碱稳定,在pH值6.0时活性最强.     

胡椒碱对番茄灰霉病菌抑制作用及其机理研究

为证明胡椒碱对番茄灰霉病菌的抑制作用并揭示胡椒碱对番茄灰霉病菌抑菌机理,观察不同质量浓度胡椒碱处理下番茄灰霉病菌的菌落直径、产孢量和孢子萌发率以及胡椒碱处理后对番茄灰霉病菌菌丝形态变化、番茄灰霉病菌可溶性蛋白含量、酶活性和细胞膜通透性的变化规律。结果表明：胡椒碱对番茄灰霉病菌有明显的抑制作用,当胡椒碱质量浓度为200mg/L时,抑菌率可达80.6%,对番茄灰霉病菌产孢率和孢子萌发抑制率分别达到88.5%和88.8%,对菌体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的抑制率分别为82.7%、69.1%和70.4%,对琥珀酸脱氢酶（SDH）和NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）抑制率分别为89.5%和94.9%;胡椒碱处理后番茄灰霉病菌可溶性蛋白含量低于对照组,细胞膜透性增强,番茄灰霉病菌菌丝变细、节间拉长、干瘪并坍塌。综上,胡椒碱可以有效抑制番茄灰霉病菌的生长,研究结果为新型植物源农药开发及番茄灰霉病防治提供了理论基础。     

油菜内生拮抗细菌SF4对油菜菌核病菌的抑制作用研究

从油菜幼苗中分离出110个内生细菌。采用平板对峙法进行筛选,有4株菌对核盘菌有不同程度的抑制作用。经连续传代10次后,菌株SF4仍具有较高的生防活性。该菌株对核盘菌的菌丝生长发育有显著的抑制效果。在显微镜的观察下,被抑制的菌丝发生畸形,内含物分布不均匀。菌株SF4的挥发性产物及无菌发酵液都能抑制核盘菌的菌丝生长。挥发性产物对菌丝的最高抑制率为33.13%。无菌发酵液的抑制效果随培养时间的不同而有显著差异,96 h的无菌发酵液抑制效果最好。菌株SF4的无菌发酵液可推迟核盘菌菌核形成的时间,减少菌核数目,也可推迟菌核的萌发。在油菜叶片离体实验中,该菌株的菌悬液及无菌发酵液对发病有明显的抑制作用。     

多孔菌发酵代谢物的抑菌活性研究

用乙酸乙酯和正丁醇分别从多孔菌(Polyporus variusPers.:Fr.)摇瓶发酵液的上清液和菌丝体中提取生物活性物质,然后分别对不同细菌和植物病原菌进行抑菌活性的测定。试验结果表明,发酵液的乙酸乙酯提取物能显著抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌;菌丝的乙酸乙酯提取物对大肠杆菌的抑制作用较强;而菌丝的正丁醇提取物对5种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的防效评价

为了探究枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的抑制作用,采用室内抑菌试验和大田试验研究了枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病菌的抑制作用及对黄瓜灰霉病的防治效果。对峙培养法测定表明,枯草芽孢杆菌YN-5对黄瓜灰霉病菌有明显的拮抗作用,对黄瓜灰霉病菌菌丝及孢子都有较强的抑制效果;盆栽试验表明,拮抗菌YN-5的抑病效果在50%以上。该菌株可作为黄瓜灰霉病生物防治的优良候选微生物资源,开发及应用前景广阔。