适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳最佳条件研究

针对大豆叶片中蛋白含量较低,含有大量色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以大豆叶片为材料,对样品制备、蛋白质裂解液组分、等电聚焦(IEF)参数等条件进行研究.结果表明:采用TCA/丙酮法提取大豆叶片总蛋白,裂解缓冲液为9 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4%CHAPS.100 mmol·L-1DTT,0.5%Bio-Lyte,IEF等电聚焦条件为24 000Vh时,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好.初步建立了一套适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)体系.     

影响木薯叶片蛋白质双向电泳图谱的因素分析

以木薯华南205为试材,采用苯酚抽提法提取叶片蛋白质,并通过双向电泳技术研究影响木薯叶片蛋白电泳分析图谱的主要因素。结果表明：pH 4～7的IPG胶条可提高特定范围蛋白质点的分辨率;上样量200 μg可得到较好的双向电泳图谱。本研究不仅为进一步研究木薯叶片蛋白电泳分析提供技术手段,同时也为分析木薯块根、茎和繁殖器官的蛋白质提供参考。     

小麦穗突变体Sda1与其野生型叶片总蛋白双向电泳体系的建立

为探索适合小麦穗突变体Sda1叶片蛋白的双向电泳体系,寻找Sda1与其野生型叶片的差异蛋白,以Sda1与其野生型的抽穗期叶片为材料,从蛋白质提取、双向电泳条件等方面对适合Sda1及其野生型叶片蛋白的双向电泳体系进行探索。分析试验得到的双向电泳图谱,发现利用TCA/丙酮提取叶片总蛋白,用pH 4~7的17cm线性胶条,采用13%浓度的分离胶,上样量为900μg,利用改良的等电聚焦程序,能够得到背景清晰、分辨率高的电泳图谱;电泳图谱在低分子区蛋白点分布均匀,并且重复性好。利用PDQuest 8.0.1软件分析图谱,得到27个差异点蛋白,相比于野生型植株,Sda1突变体表现为蛋白表达量下调与缺失,发现6个缺失蛋白,21个表达下调蛋白。     

玉米叶片总蛋白提取和双向电泳技术的改进

针对植物组织蛋白质含量较低,有些组分在两性电解质中的溶解性低以及绿色组织中的色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以玉米苗期叶片为材料,对蛋白质裂解液、蛋白质浓度测定体系、等电聚集电泳电压和时间、聚丙烯酰胺凝胶浓度等技术参数做了改进。用改进的裂解液提取的蛋白质样品浓度达3.8μg/μL,比改进前提高90%。通过在浓度测定体系中加入HCl并用裂解液代替超纯水配制标准蛋白,可得到线性更好的蛋白浓度测定标准曲线。用改进后的等电点聚焦电泳的电压、时间和聚丙烯酰胺凝胶浓度,可从玉米叶片总蛋白质样品中分离出963个清晰的蛋白点,在其他条件相同的情况下,比改进前的技术体系多分离出429个蛋白点。     

野生大豆叶片蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

为给野生大豆蛋白质组学分析提供技术支撑,以耐盐碱野生大豆叶片为材料,对Tris-饱和酚法、Tris-HCl法和TCA-丙酮法3种蛋白质提取方法进行了比较,并对蛋白上样量、等电聚焦参数及凝胶浓度进行了优化。结果表明:使用Tris-饱和酚法提取蛋白质,上样量为2 000μg,等电聚焦90 000 V·h,凝胶浓度为10%时,可获得背景清晰、蛋白点数较多、重复性较好的蛋白双向电泳图谱。     

华南8号木薯块根形成期叶绿体蛋白质组学分析

以‘华南8号’木薯块根形成期叶绿体为材料,采用改进酚抽法提取总蛋白,通过一维和二维电泳,经Image Master分析,获得了木薯叶绿体的蛋白质表达谱,发现(397±31)个蛋白点;挖取2-DE凝胶上相对丰度较高的蛋白点275个,利用改进的酶解方法进行胶内酶解,经MALDI-TOF MS质谱鉴定,获得208个蛋白点,对应143种蛋白质,这些蛋白主要参与光合作用、光合生物碳固定、氧化还原调节、氨基酸代谢、蛋白质代谢和转运等途径。结果为后期从蛋白质组水平深入研究木薯叶绿体高光效机制提供一定参考。     

不同品种木薯叶绿体比较蛋白质组学初步研究

以“华南8号”木薯(SC8)和“华南124号”木薯(SC124)的叶绿体作为研究材料,采用改进酚抽提法提取蛋白,通过单向SDS-PAGE电泳和双向SDS-PAGE电泳,比较不同木薯品种叶绿体的蛋白表达谱,并对表达的差异蛋白进行MALDI-TOF MS质谱鉴定,获得15个差异蛋白,其中有6个蛋白在SC124木薯叶绿体中表达较高,9个蛋白表达很低.对蛋白进行功能分析,发现差异蛋白主要参与蛋白翻译后修饰、周转、分子伴侣、碳水化合物运输等过程.通过RT-PCR验证了木薯核酮糖1.5-二磷酸羧化酶、ATP合酶β亚基的基因表达情况,结果表明,ATP合酶β亚基基因表达与蛋白质的表达比较一致,而核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因与蛋白质表达变化不一致.     

木薯MeSAP13基因的克隆及其抗细菌性枯萎病功能鉴定

胁迫相关蛋白（stress-associated proteins, SAPs）在植物对胁迫应答和胁迫调控中起重要作用。木薯是我国重要的粮食作物和经济作物,细菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）已严重危害我国木薯产业的健康发展。为了探讨木薯MeSAP基因在抗细菌性枯萎病中的作用,本研究克隆了我国主栽木薯品种‘华南8号’（SC8）的MeSAP13基因,分析该基因在细菌性枯萎病病原菌侵染时的表达模式及其编码蛋白的基本特性。利用基于木薯花叶病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）技术抑制了MeSAP13基因在木薯SC8叶片中的表达,通过接种细菌性枯萎病病原菌XpmHN11对MeSAP13的抗病功能进行抗性鉴定。结果发现：在病原菌XpmHN11侵染叶片3 d后MeSAP13基因表达量显著上调,说明木薯MeSAP13基因能够响应病原菌的侵染;在VIGS载体转化木薯叶片40 d后发现,与转化pCsCMV-A载体的对照叶片相比,MeSAP13在转化pCsCMV-MeSAP13叶片中的表达量显著下调了40%~60%,表明通过VIGS技术成功抑制了MeSAP13在木薯叶片中的表达。将病原菌XpmHN11接种至MeSAP13基因沉默叶片和对照植株叶片,发现MeSAP13基因沉默植株接种叶片的水渍状病斑面积显著大于对照植株接种叶片。分析侵染后0、3、6 d病原菌XpmHN11的繁殖情况发现,在侵染后3 d和6 d的MeSAP13基因沉默植株接种叶片中,其病原菌数量显著高于对照植株接种叶片。以上研究结果表明,抑制MeSAP13基因的表达,降低了木薯对细菌性枯萎病的抗性。     

小麦L699叶片受白粉菌胁迫后蛋白质的差异表达

为从蛋白组学角度认识小麦抗白粉病机制,以含有抗白粉病新基因Pm40的小麦品系L699为材料,采用蛋白质双向电泳和质谱技术(MALDI-TOF-MS)检测小麦叶片接种白粉菌24h后的差异蛋白。结果表明,经PDQuest软件分析,接种白粉菌后小麦叶片中有18个蛋白质斑点表达量上调,38个蛋白质斑点表达量下调。对表达量上调的蛋白质斑点进行质谱分析和数据库检索,共鉴定出15种蛋白质,其中13种参与防御反应、碳水化合物代谢和蛋白质周转。这些差异蛋白与抗病途径、植株生理过程密切相关,在小麦抗白粉病过程中起很重要的作用。     

大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良

以大豆叶片为材料,比较分析了3种蛋白质的提取方法,讨论了等电聚焦时间和染色方法等关键因素对双向电泳的影响,同时选择不同的IPG胶条,设定了第1向等电聚焦和第2向SDS-PAGE电泳的电泳程序及参数.结果表明:采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质,选择pH 4 ～7( 17 cm) IPG胶条,适当延长和改变等电聚焦的第2步...     

聚乙二醇胁迫下茶树叶片的蛋白质组分析

应用差异蛋白质组学方法分析了铁观音茶树幼苗在聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)胁迫下叶片蛋白质组的变化。对18个蛋白质点在PEG胁迫下的变化特点进行了分析,并对有差异表达的16个蛋白质点进行了质谱分析,共鉴定出14个蛋白质点,代表了10种不同的蛋白,其中5个点是同一个蛋白(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基,RubisoLSU),另9个蛋白是PEG胁迫响应蛋白,包括光合系统II23kDa多肽、叶绿体伴侣蛋白21(ch-Cpn21)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、三磷酸腺苷合酶β亚基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白(CEN)、新生多肽相关复合物α亚基(α-NAC)、20S蛋白酶体α亚基(PAE2)、翻译起始因子5A(eIF5A)等,这些蛋白质分别参与了叶绿体组成、糖代谢、能量代谢、硫代谢、蛋白质代谢、信号转导、基因表达调节和细胞程序性死亡等生命活动过程。     

Characterization of seed proteome in Brachypodium distachyon

Brachypodium distachyon, an emerging model plant system for some economically important temperate grasses such as wheat, barley and switchgrass, has recently caught wide attention in modern biological research. In the current study, the glutenin, albumin and globulin components of 13 B. distachyon accessions were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) followed by peptide mass finger printing (PMF) and MS/MS protein identification. Abundant wheat low molecular weight glutenin subunit (LMW-GS) like proteins and a few high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) with low expression level were detected in B. distachyon. A total of 18 storage proteins and 15 albumin proteins were identified through PMF and MS/MS. The results demonstrated that the major seed storage proteins in B. distachyon are wheat LMW-GS like proteins and globulins. The identified albumins and globulins were mostly various enzymes that were classified into five groups according to their functions. The 2-DE spot distribution and MS results suggested that post-translational modifications (PTMs) such as phosphorylations and glycosylations are common phenomena in B. distachyon seed proteome.     

巴西橡胶树叶片蛋白样品的制备及质谱初步分析

采用TCA-丙酮沉淀法并稍做改进提取巴西橡胶树叶片总蛋白,蛋白溶解后,用试剂盒对蛋白上清液进行纯化和浓度测定。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向凝胶电泳(2-DE)的结果均表明,所制得的蛋白样品质量较高,并且纯化过的蛋白样品2-DE(双向电泳)图谱效果更好(7 cm,考染)。根据预实验结果,选用17 cm IPG预制干胶条对纯化的蛋白样品进行2-DE实验,采用快速银染法进行染色,随机挖取银染胶上6个蛋白点进行MALDI-TOF MS分析和数据库检索,鉴定了3个蛋白,它们是：1-氨基环丙烷-1羧酸合酶2,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基和F11O4.2。本实验为进一步对巴西橡胶树叶片中具有重要生物学功能蛋白的筛选和鉴定打下了方法学基础。     

巴西橡胶芽接树砧穗互作的蛋白质组初步研究

运用蛋白质组学研究技术,寻找砧木和接穗互作相关蛋白。以巴西橡胶树3种芽接组合植株的砧木与接穗结合部附近处的胶乳为试验材料,经双向凝胶电泳(2-DE)分离获得胶乳中存在的差异表达蛋白,采用质谱技术鉴定出32个差异表达蛋白,这些蛋白主要参与转录、翻译、光合作用、细胞分裂、蛋白质合成和胶乳合成等生物学过程。     

南丰蜜桔贮藏期间果皮褐变的蛋白质组分析

为探讨南丰蜜桔采后蛋白质组的变化,采用酚抽法提取果皮蛋白,建立南丰蜜桔果皮蛋白质组研究中的双向电泳技术,获得了重复性好、分辨率高的蛋白质图谱。利用PDQuest软件对所得到的双向电泳图谱进行比较分析,共得到差异蛋白质点45个,其中上调表达的蛋白点有33个,下调表达的蛋白点有12个,这些差异蛋白点可能与果实贮藏相关。     

种植密度和方式对油莎豆块茎生长期光合特性和产量的影响

作物产量与群体结构密切相关。为合理配置群体结构,提高油莎豆光能利用率并最终提高产量,研究不同群体结构对油莎豆块茎生长阶段光合特性和产量的影响,以进一步挖掘黑龙江省中西部地区油莎豆产量潜能。2018年以黑油莎2号为材料,采用三因素大田裂裂区试验设计,主区为种植密度,分别为90 000株/hm²（A1）、110 000株/hm²（A2）、130 000株/hm²（A3）;裂区为种植方式,分别为110 cm垄上三行（小行距30 cm）（B1）,65 cm垄上双行（小行距20 cm）（B2）,45 cm垄上单行（B3）;裂裂区为留苗方式,分别为矩形留苗（C1）,三角留苗（C2）,共18种处理,3次重复。通过测定群体光合速率（CAP）、叶绿素a+b（Chla+b）含量及荧光参数（Fv/Fm和qP）,研究不同处理对油莎豆块茎生长阶段群体光合特性和产量形成的影响。结果发现：油莎豆块茎形成期,群体光合速率随着种植密度的增加而增大,3种密度处理间差异显著（P<0.05）;块茎增长期和成熟期,群体光合速率随着种植密度的增加呈先增后降的趋势。随着种植密度的增加,油莎豆块茎形成后0 d,冠层和下部叶片叶绿素a+b含量、最大光能转化率Fv/Fm、光化学猝灭系数qP均呈逐渐增加趋势;块茎形成后25~75 d,冠层和下部叶片叶绿素a+b含量、最大光能转化率Fv/Fm、光化学猝灭系数qP呈先增后降趋势。相同密度和留苗方式条件下,群体光合速率、叶绿素a+b含量、Fv/Fm及qP所测指标表现为种植方式B2最大,较B1、B3差异均显著（P<0.05）;相同密度和种植方式下,上述所测指标表现为留苗方式C2更大,较C1差异显著（P<0.05）。A2B1C2处理产量达到7520.45 kg/hm²,在所有处理中最高。合理的种植密度是提高油莎豆产量的关键。适宜密度下,合理的宽窄行配置和三角留苗方式可有效改善群体结构,提高群体光合速率,增加叶绿素a+b含量,提高最大光能转化率Fv/Fm和光化学猝灭系数qP,是实现植株个体与群体相互协调并提高产量的重要途径。     

白叶1号白化过程中叶绿体蛋白质组差异分析

白叶1号是一种温度敏感型白化茶树品种,叶绿体的变化是其产生阶段性白化现象的关键因素。本研究以白叶1号鲜叶叶绿体为研究对象,采用双向电泳、质谱鉴定结合生物信息学分析,研究阶段性白化过程中叶绿体蛋白的表达差异,探讨白叶1号阶段性白化现象的分子机制。结果表明,在白叶1号白化前期、白化期和复绿期叶绿体中分别识别726、748、718个蛋白质,其中差异表达的蛋白59个,质谱成功鉴定22个差异表达蛋白。生物信息学分析表明,差异表达蛋白直接或间接参与了光合作用、应激响应、核酸代谢、物质代谢和未知功能等,其中与光合作用相关的差异表达蛋白最多,占31.82%,表明阶段性白化现象可能与这些生理功能相关。通过荧光定量PCR分析发现,差异蛋白的基因表达与蛋白表达存在一定差异,这可能是由于蛋白质翻译后加工及修饰造成的。上述研究为进一步揭示白叶1号阶段性白化现象产生的分子机制奠定了理论基础。     

油茶雌蕊蛋白双向电泳分离体系的建立

通过比较不同的蛋白提取方法、裂解液成分、离心速率、等电聚焦程序,以及不同浓度的SDS-PAGE凝胶,建立最适于油茶雌蕊总蛋白的双向电泳体系。结果显示:TCA/丙酮+SDS/酚抽法提取蛋白,裂解液[7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,80 mmol/L DTT,4%(W/V)CHAPS,2%(V/V),IPG buffer(p H 3-10L)]复溶蛋白干粉,20 000 r/min离心;等电聚焦程序为:100 V 1 h,200 V 2 h,500 V 3 h,1 000 V 2 h,8 000 V 2 h,8 000 V62 000 Vh,500 V 10 h;10%SDS-PAGE凝胶浓度,为适合油茶雌蕊蛋白的双向电泳体系。这些结果为油茶雌蕊蛋白组学的研究奠定了技术基础。