WSSV-VP37小肽在大肠杆菌中的偏爱型表达

选用对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)囊膜蛋白VP37的功能区段,利用大肠杆菌密码子偏爱性,在氨基酸不变的情况下将VP37中的密码子通过人工合成改为大肠杆菌偏爱型密码子,并克隆至表达载体pBAD/gIIIA中,构成重组载体pBAD/gIIIA-VP37p′.将重组载体转化入大肠杆菌Top10中,在相同条件下用L-阿拉伯糖与未优化的重组菌株Top10-pBAD/gIIIA-VP37p一同诱导.结果显示,与野生型基因VP37p相比,经密码子优化的VP37p′基因表达目的蛋白量占总蛋白的40.5%,明显高于野生型6.5%的目的蛋白表达量.     

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW2－104为培养菌株,进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明,在以1％葡萄糖为碳源,以3.5％豆饼粉为氮源,无机盐：0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.1%Na2CO3、0.2?Cl2,起始pH值7.0,接种12h种龄的种子4％,20℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养36h,菌株产酶活性最高。     

产木聚糖酶菌株YS1069的产酶条件优化

为获得较高的木聚糖酶产量,采用单因素实验和响应面实验方法,筛选氮源、碳源、无机盐、接种量、装液量、Na2CO3、发酵温度、发酵时间多个单因素,对产木聚糖酶的芽孢杆菌YS1069的发酵培养基和发酵条件进行了优化.结果显示,豆饼粉25 g/L、麸皮40g/L、NaNO3 0.9 g/L、K2HPO43g/L、MgSO4·7H2O 0.6 g/L、接种量4％、装液量30 ml/250 ml(v/v)、Na2CO3添加量18 g/L、培养温度30℃、培养时间96 h时,酶活性达到最高.再通过Plackett-Burman设计对影响木聚糖酶产量的8个主要因素进行评价,确定Na2CO3浓度、麸皮浓度和MgSO4·7H2O浓度是影响产酶量的3个主要因素.利用中心组合设计及Design-Expert 8.05软件分析,获得了主要因素的最优条件,即Na2CO3浓度21.86g/L、麸皮浓度51.41 g/L、MgSO4·7H2O浓度0.59 g/L,实验最终酶活性比发酵优化前提高了5倍.     

海洋细菌S-12-86的产溶菌酶条件

从中国东海海域底泥中筛选获得一株产溶菌酶的海洋细菌S-12-86,采用摇瓶发酵的方式,分别从培养基组分与发酵条件两个方面对海洋细菌S-12-86产酶的影响进行研究。结果表明,菌株S-12-86能够利用麦芽糖、淀粉、甘油和葡萄糖作为碳源,不能利用蔗糖与甘露醇;能够利用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨和硫酸铵作为氮源,其中牛肉膏效果最佳,而硝酸钾、氯化铵和尿素几乎不能被利用;Zn2 、Mn2 、Cu2 对菌株S-12-86的生长和产酶均有抑制作用;Fe2 对菌体生长无明显影响,但明显抑制菌体产酶;Na 、K 对菌体的生长和产酶无明显影响;Ca2 对菌体生长有促进作用;Mg2 对菌体生长和产酶均有促进作用。菌株S-12-86最适发酵条件为:培养温度30℃、接种体积比4.0%、装液量体积比10.0%、产酶高峰在发酵开始后24 h。与白色链霉菌G(Streptomyces albusG)、灰色链霉菌P-51(S.griseusP-51)、枯草芽孢杆菌77(Bacillus subtilis77)等产溶菌酶微生物的产酶条件相比较,菌株S-12-86具有易培养、产酶量较高、生产成本较低等优点。因此,菌株S-12-86有较大的生产开发潜力。     

唾液乳杆菌NF19的液体发酵条件研究

从舟山海域海水中筛选到一株海洋细菌NF19,经16S rDNA分子鉴定和API鉴定结果显示菌株NF19为唾液乳杆菌属(L.salivarius)的一个种,将序列上传至NCBI获得GenBank登录号为FJ405036。通过对菌株NF19进行发酵条件优化及正交试验,得到菌株NF19的最佳发酵条件为:初始pH7.2,接种量为8%,在120 r/min下20℃培养48 h。此条件下发酵液有最佳抑菌效果。     

斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的发酵

将含有石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母X33进行震荡培养后,装入≥50L的自控罐中,28~30.5℃、pH 5.5~6.0、溶解氧≥30mg/L条件下发酵84h,生产石斑鱼生长激素基因重组蛋白。发酵期间,通过甲醇诱导毕赤酵母获得目的蛋白的高效表达,最后通过Western Blot和SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳对目的蛋白进行定性定量检测。最终获得目的蛋白表达量约为1.5~2.0g/L,约占胞外可溶性总蛋白的16.4%。本试验用自控罐发酵生产含有斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的毕赤酵母生产工艺,为实现工业化生产鱼类生长激素饵料添加剂奠定基础。     

高产壳聚糖酶菌株的筛选及其产酶条件的优化

从虾塘底泥中分离到1株高产壳聚糖酶的菌株,将其命名为QY01.研究发现其最适培养基组分为胶体壳聚糖1.0%、葡萄糖0.1%、酵母粉0.3%、K2HPO4·3H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO4 0.5%、起始pH 6.最适培养条件为6%接种量,30℃、160 r/min培养72 h,在此条件下发酵液酶活可达10.87 U/mL,表明筛选到的菌株在降解壳聚糖方面具有较好的利用价值和开发前景.对QY01进行了16S rDNA形态特征及生理生化特性鉴定分析,经序列比对,该菌株与芽孢杆菌属的同源性高达99%;形态特征与生理生化鉴定结果与16S rDNA鉴定结果相符,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.).     

高产壳聚糖酶菌株的筛选及其产酶条件的优化

从虾塘底泥中分离到1株高产壳聚糖酶的菌株,将其命名为QY01。研究发现其最适培养基组分为胶体壳聚糖1.0%、葡萄糖0.1%、酵母粉0.3%、K2HPO4·3H2O0.2%、MgSO4·7H2O0.1%、NaCl0.5%、(NH4)2SO40.5%、起始pH6。最适培养条件为6%接种量,30℃、160r/min培养72h,在此条件下发酵液酶活可达10.87U/mL,表明筛选到的菌株在降解壳聚糖方面具有较好的利用价值和开发前景。对QY01进行了16SrDNA形态特征及生理生化特性鉴定分析,经序列比对,该菌株与芽孢杆菌属的同源性高达99%;形态特征与生理生化鉴定结果与16SrDNA鉴定结果相符,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)。     

过氧化氢酶高产菌株CE-2-A的发酵条件优化

为了提高气单胞菌属菌株CE-2-A的过氧化氢酶产量,对其发酵条件进行优化。首先运用了单因子试验筛选出了发酵培养基的麦芽糖含量、牛肉膏含量、CaCl2和MgCl2含量,在此基础上采用Plackett-Burman设计法,对8种影响产酶的因素进行评价。试验结果表明,牛肉膏含量、起始pH、摇瓶装液量对菌株产过氧化氢酶的活力具有显著的影响。通过Box-Behnken试验考察了牛肉膏含量、起始pH、摇瓶装液量这3个主要因素对菌株所产过氧化氢酶活力的影响。发酵条件优化结果为装液量42.6ml、牛肉膏含量3.69g/L、起始pH9.1,采用优化后发酵培养条件进行摇瓶发酵培养,过氧化氢酶的酶活力达到2532.5U/ml,与优化前酶活力(1849.7U/ml)相比提高了36.9%。     

饲用大豆肽生产菌株的初步筛选及发酵条件研究

通过发酵试验对三株芽孢杆菌进行筛选,并确定该菌株的最佳接种量、种龄和摇床速度。对其发酵条件进行优化,结果表明最适条件为:加水量94%、温度30℃、180r/min旋转摇床48h。发酵液的水解度达到15.9%,比优化前提高了1.92倍。     

翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白表达、纯化及特性分析

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶。根据翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)Cu/Zn-SOD基因序列(Gen Bank登录号:KJ558392.1)设计表达引物,扩增获得截去信号肽后的一段460 bp的序列,序列经过鉴定后,构建了重组表达质粒p ET-30a+Sc Cu/Zn-SOD,并将该质粒转入到BL21(DE3)中,用IPTG诱导进行表达。经过优化表达条件得到可溶的Sc Cu/Zn-SOD重组蛋白(rScCu/Zn-SOD),纯化重组蛋白后测定rScCu/Zn-SOD的浓度和酶活性。结果发现在20℃和37℃条件下均能够诱导Sc Cu/ZnSOD的表达。37℃时重组蛋白主要以包涵体形式存在。降低诱导温度和补充Cu~(2+)/Zn~(2+)可提高rScCu/Zn-SOD的表达量。在20℃、0.5 mmol/L IPTG条件下,添加0.5 mmol/L CuSO_4和0.1 mmol/L ZnCl_2于培养基中,重组蛋白的表达量明显升高。纯化后的重组蛋白浓度为0.14 mg/m L,酶活力为108.5 U/mg。rScCu/Zn-SOD最适温度为37℃,最适pH为7.0,可耐受5%浓度的SDS蛋白质变性剂。     

传染性胰腺坏死病病毒分离株VP2基因抗原表位区融合表达及免疫特性的分析

利用RT-PCR方法扩增出IPNV-ZYX分离株主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(616 bp), 命名为IPNV VP2 COE, 将其克隆到pCold TF表达载体中构建重组质粒pCold TF-VP2 COE, 在大肠杆菌BL21(DH5α)感受态表达, 经SDS-PAGE电泳分析, 表达蛋白约78 ku, 用镍离子亲和层析柱纯化该蛋白, 制备抗血清, 间接ELISA结果显示, IPNV (ATCC VR-1318)细胞培养物与鼠抗VP2 COE蛋白血清发生特异性反应, 效价为1∶12 800; 间接免疫荧光结果显示, 鼠抗VP2 COE血清可与黑龙江某渔场已知感染IPNV虹鳟肝组织产生特异性的荧光, 以上两项结果表明, 表达IPNV VP2 COE蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性, 为IPNV检测方法的建立及疫苗的制备提供理论依据     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26的毕赤酵母组成型分泌表达

近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。     

乳糖诱导对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28基因在重组大肠杆菌中的表达

以含对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）囊膜蛋白VP28编码基因质粒的重组大肠杆菌Escherichia coliB121作为研究对象,研究了乳糖或乳清粉代替IPTG作为诱导剂诱导重组囊膜蛋白VP28的表达。结果表明,乳糖不仅能够作为诱导剂诱导重组大肠杆菌进行外源蛋白的表达,而且能作为碳源促进菌体的生长。通过对诱导条件的优化,乳糖在发酵培养基的添加量为8g·L^-1,发酵时间为12h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为97．36mg·L^-1。试验亦使用乳清粉作为发酵培养基的碳源和诱导工程菌表达的诱导剂。结果表明,在发酵培养基中添加乳清粉作为碳源和诱导剂,使其乳糖终浓度为10g·L^-1,发酵时问为13h时可以获得最高的目的蛋白表达量,为86．24mg·L^-1。     

牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性研究

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡,成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用HEK293t细胞,构建OsHV-1主要核衣壳蛋白（ORF104和ORF33）的真核表达系统,并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行检测。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列,根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果,选择pCDNA3.1构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后,利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1-orf 104与pCDNA3.1-orf 33分别单独或共转染至人胚肾细胞(HEK293t)。然后,将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹检测(Western Blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示,实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体,通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明,表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染,共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体,其中,ORF33自身即可形成分子量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达,为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作,以及病毒入侵机制研究奠定基础。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。     

黄鳍鲷白细胞介素1基因原核表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1（interleukin-1,IL-1）基因全长cDNA序列（GenBank登录号为AY669059）设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1。以克隆载体pMD18T-IL1为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1和pQE30-mIL1。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1基因的体外重组表达研究打下了基础。     

foxl3重组质粒过表达与17ɑ-甲基睾酮投喂对斜带石斑鱼性腺发育的影响

通过foxl3重组质粒过表达与MT投喂对比,探究一种新型的调控斜带石斑鱼性腺发育的方法。以foxl3重组质粒注射以及MT投喂3月龄的石斑鱼幼鱼,观察性腺发育状态,利用荧光定量PCR检测分析性腺分化相关基因的表达。结果显示：质粒注射初期性腺注射组卵巢较对照组小,体细胞较多,存在向雄性方向发育的趋势（存在睾丸间质细胞）,且质粒注射初期的雄性相关基因—amh,激素生成相关基因—cyp11b、11β-hsd2,精子发生相关基因—rec8和sycp3的相对表达量显著高于对照组。MT投喂组后期的性腺组织处于明显的兼性发育期,而对照组仍处于O2期卵母细胞期;MT投喂组,amh、cyp11b、11β-hsd2、rec8和sycp3基因相对表达量趋势与质粒注射一致,但投喂组与对照组之间的差异较质粒注射更显著。在本实验条件下,MT投喂调控性腺雄性化的效果较foxl3质粒注射的效果明显。以上结果表明,foxl3重组质粒过表达对斜带石斑鱼幼鱼性腺发育具有明确的雄性化调控作用,且这种调控可能具有剂量依存效应。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。