河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)又称为干扰素γ诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF).Okamura and Tsutsui(1995)首次从中毒性休克的鼠肝脏中克隆出了该因子.Muneta et al.(1999,2000)从猪肺泡巨嗜细胞中克隆到pIL-18,并证明表达pIL-18的成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性.本研究选择河南省普遍喂养的良杂猪,对其IL-18基因进行扩增及序列测定,并实现了成熟蛋白在大肠杆菌中的初步表达.     

牛IL-18融合蛋白的原核表达及生物学活性测定

将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)获得重组菌株。该重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳表明,BoIL-18融合蛋白获得了高效表达,分子量约为44kD,凝胶薄层扫描分析显示,融合蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;用亲和层析法对表达产物进行纯化,检测纯化产物的生物学活性。对外周血单核细胞(PBMC)的增殖实验证明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对PBMC有明显的增殖作用;对IFN-γ的诱生实验显示,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20mg/L时,能促进IFN-γ的产生,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强。     

麻鸭白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性

根据GenBank发表的鸭IL-18 cDNA基因序列，设计、合成一对引物，直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增麻鸭IL-18成熟蛋白基因，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了麻鸭IL-18成熟蛋白基因全序列，其大小为513 bp，编码一条由170个氨基酸残基组成的多肽。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达质粒pQE30-mDuIL18，转化大肠杆菌M15，并用IPTG 诱导。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19.76 Ku的重组蛋白，Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后进行鸭T淋巴细胞转化试验表明，重组蛋白具有明显促进鸭T细胞转化的生物学活性。用mDuIL-18（150 ng or 200 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫鸭2周后，HI抗体平均滴度达到7.5–7.7 log 2 ，而只用AIV 疫苗免疫和用mDuIL-18（100 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3–6.6 log 2，表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。这为研究鸭IL-18结构和生物学应用，以及研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定基础。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

牛白细胞介素18的原核表达及其生物学活性研究

将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中，并在宿主菌BL21（DE3）中进行表达；用BoIL-18在昆虫细胞中的表达产物制备的兔多克隆抗体作为一抗进行Western blot分析；采用亲和层析法，对表达产物进行纯化；利用MTT染色法研究重组BoIL-18（re BoIL-18）对牛外周血单核细胞(PBMC) 增殖的促进作用；采用双抗体夹心ELISA法研究reBoIL-18诱导脾淋巴细胞产生IFN-γ的情况；采用微量细胞病变抑制法检测reBoIL-18对VSV导致细胞病变的抑制作用。结果:得到了BoIL-18的高效表达产物，表达量为31.8％，Western blot 显示，在44KD处有一特异性条带；纯化后获得了纯度较高的reBoIL-18蛋白；纯化的BoIL-18对PBMC增殖具有明显的促进作用，并且能够促进IFN-γ的诱生和抑制VSV病毒的活性。     

鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测

对含有鸡白细胞介素-18(ChIL-18)基因的质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)内进行诱导表达,经亲和层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明,经诱导表达出分子量44kD的目的蛋白(与GST融合表达),纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/mL时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/mL;但该蛋白不能直接抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长;能够刺激淋巴细胞显著增殖,浓度为250ng/mL时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/mL时,作用最强。利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白与天然鸡IL-18蛋白一样具有较广泛的生物学活性。     

水牛α-干扰素基因的克隆与表达及其抗病毒活性

从福安和富钟水牛(water buffalo，WB)基因组中克隆了其α-干扰素基因Fa-WBIFN-α,和Fz—WBIFN-α,，并分别与pQE30表达载体连接、测序后用IPTG诱导表达。结果表明，水牛IFN—α基因全长498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α-干扰素(BoIFN—α)8个亚型氨基酸序列同源性为91．6％～94．2％，均为BoIFN—α的新亚型。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约为20kD，表达量占菌体总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在。经包涵体提取、尿素变性和复性后，重组水牛α-干扰素(rWBIFN—α)在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的活性分别为10^5U／mg和10^6U／mg。并且，rWBIFN-α对传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV)感染有抑制作用。     

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

犬白细胞介素-2 基因(IL-2 )的克隆与表达

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列，设计了1对引物。采用RT-PCR技术，以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料，从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550bp。分离纯化片段，克隆入pMD18-T载体，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致，生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，IPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳显示21．8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明：表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。     

融合基因mChIL-18/mChIFN-α克隆及其原核表达载体的构建

分别以鸡白细胞介素18成熟肽基因(mChIL-18)和鸡α-干扰素成熟肽基因(mChIFN-α)为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到融合基因mChIL-18mChIFN-α。将融合基因克隆于pGEM-T Easy载体后,再亚克隆到原核表达载体pQE30,并进行测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的融合基因mChIL-18mChIFN-α。SDS-PAGE可检测到分子质量为39.4kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

杏山梨醇脱氢酶基因克隆及其在果实发育过程中的表达与酶活性分析

为研究杏山梨醇脱氢酶(SDH)的基因序列特征、在杏果实发育过程中的表达及其酶活变化,以金太阳杏为试验材料,采用同源克隆的方法克隆杏NAD+依赖的SDH编码基因的cDNA序列,命名为PaSDH,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析PaSDH在杏果实发育过程中的表达水平,检测酶活变化.序列分析结果表明,PaSDH...     

马白细胞介素-18单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

摘要：利用纯化的用原核系统表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白(pET-mEIL-18)抗原免疫BALB/c 小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，同时以昆虫杆状病毒表达系统获得的马白细胞介素-18成熟蛋白(mEIL-18)作为抗原进行间接ELISA检测，筛选并最终得到了9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IFA试验对9株单克隆抗体进行鉴定，结果证实所获得的9株细胞分泌的抗体都是针对mEIL-18的特异性抗体。将此9株单克隆抗体分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)和pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)蛋白进行特异性ELISA检测，结果表明，9株单克隆抗体有5株识别表达的pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)，而另外4株单克隆抗体与pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)发生反应，说明所获得的9株单克隆抗体至少针对pET-mEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示，除M1F11、M3A11和N7D9为IgM，其余的单克隆抗体均为IgG1，而且所有单克隆抗体的轻链均为?资链。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究

根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-21b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成,推导的分子量为81.2kD。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白,是一种新的Cry1Ia蛋白,该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明:Cry1Ia8对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50分别为0.268μg/g和2.227μg/mL,其杀虫效果与Cry1Ab和Cry1Ac相当。对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)也有较好的活性,但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲(Pyrrhalta aenescens)没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源,为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了重要依据。