6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用

为研究荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,建立了Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全质量浓度的基础上,结合细胞形态观察和MTT法,对PRRSV进行阻断、抑制、灭活3种作用方式的测定。结果显示,荆芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖对Marc-145细胞的最大安全质量浓度分别为0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、1.56 mg/mL和0.47 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,从细胞形态观察发现,委陵菜和虎杖药物组均未出现明显的细胞病变,其余4种药物组都出现了不同程度的细胞病变;从对PRRSV的抑制率来看,荆芥对PRRSV的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为80.6%、52.2%和56.5%,委陵菜3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为115.8%、93.0%和125.4%,啤酒花3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为61.5%、32.0%和82.4%,翻白草3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为15.6%、129.4%和57.7%,百部3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为120.2%、61.8%和71.9%,虎杖3种作用方式对PRRSV的最高抑制率分别为110.4%、94.3%和130.8%。综合细胞形态观察和抑制率结果,委陵菜和虎杖抗PRRSV的效果最好,其次是荆芥和百部。     

猪α干扰素的表达及在PAM细胞系中抗PRRSV活性检测

为研究猪α干扰素蛋白功能和了解猪α干扰素蛋白的抗病毒活性,扩增并测序了猪α干扰素基因(IFN-α),并克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-IFN-α,将pET-IFN-α转化至BL21进行表达。Western-Blot结果表明,表达的蛋白具有很好的生物学活性。用细胞病变抑制法在PAM细胞系上进行抗病毒活性测定,结果表明,猪α干扰素有较为显著的抗PRRSV活性,其抗病毒活性效价约为1.13×106U/mg。     

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。     

中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

采用细胞培养的方法测定了黄芪、板蓝根等6种中药在细胞安全浓度范围内抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用.试验结果表明,药物的最大无毒作用浓度为黄芪12.5 mg/mL、板蓝根3.125 mg/mL、甘草3.125 mg/mL、山楂3.125mg/mL、鱼腥草1.526 mg/mL、青蒿1.526 mg/mL.先加药物后加病毒时,6种中药的保护作用均显著;先加病毒后加药物时,鱼腥草的作用比较稳定,而板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL保护率较高;药物与病毒孵育后加药,板蓝根在3.125 mg/mL、1.562 mg/mL的作用比较明显.     

3种半边莲提取物体外抗猪繁殖与 呼吸综合征病毒的作用研究

为研究半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,本试验建立了Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全质量浓度的基础上,结合细胞病变形态观察和MTT法,设立药物组、利巴韦林阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组,对病毒进行阻断、抑制和直接杀灭3种作用方式的测定。结果显示,半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱和利巴韦林的最大安全质量浓度分别为2.5、1.25、0.63和0.016 mg·mL~(-1)。在体外抗PRRSV作用的试验中,半边莲水提取物对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为52.1%、60.2%、52.6%,极显著低于阳性对照利巴韦林(P0.01),且各作用方式下均出现明显的细胞病变。半边莲总黄酮对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为51.1%、85.0%、93.9%,其抑制和直接灭活作用较强,极显著高于阳性对照利巴韦林(P0.01),且在这两种作用方式下细胞基本保持单层完好。半边莲总生物碱对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为91.2%、57.8%、58.1%,其对PRRSV在抑制作用和直接灭活作用下的抑制率显著低于阳性对照利巴韦林(P0.05),对PRRSV阻断作用极显著强于阳性对照利巴韦林(P0.01),且在阻断作用下细胞轻微病变。综合3种作用方式,3种半边莲提取物均具有体外抗PRRSV的作用,其中,半边莲总黄酮抗PRRSV的效果最好,其次是半边莲总生物碱,半边莲水提取物抗PRRSV效果最弱。     

广西PRRSV、PCV、CSF的混合感染及PRRSV分子病原学研究

为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况,从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及猪瘟病毒(CSF)检测,并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示,经PCR检测,86份样品中有60份为PRRSV阳性,36份为PCV阳性,2份为CSF阳性,说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSVORF5基因序列比较分析发现,来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源,核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,推导编码的氨基酸序列同源性为98.0%~100.0%;与VR2332和LV株的核苷酸序列同源性分别为88.7%~89.7%和62.2%~63.1%,氨基酸序列同源性分别为88.6%~89.6%和60.5%~61.3%,表明7个县市不同毒株的ORF5基因区域变异不大,均属美洲型。     

芪板青颗粒体外抗PRRSV效果研究

为了检验芪板青颗粒体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒效果,降低养猪场因感染猪繁殖与呼吸综合征病毒带来的损失,本试验通过调整芪板青颗粒溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒液加到Marc-145细胞中的不同顺序,分别检验芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制、杀灭和阻断作用。结果显示：芪板青颗粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒有一定的抑制、杀灭和阻断作用,在芪板青溶液浓度为24.4～3 125.0 mg/L时,有显著的抑制和杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒作用,在浓度195.3～3 125.0 mg/L时,有显著的阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒作用。结果表明：芪板青颗粒可用于体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒,本试验为芪板青颗粒的应用提供了依据,为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了帮助。     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

PRRSV 的病毒蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的病毒性疾病,给世界养猪业造成了极大的威胁.从猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组、非结构蛋白和结构蛋白3个方面对PRRSV的病毒蛋白研究进展进行综述.     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

从屠宰场采集卵巢。抽吸法回收2～6mm大腔卵泡卵母细胞。随机抽样后,测量其直径为167.42±17.43μp。A,B级卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,其成熟率为67.50％。山羊新鲜精液以BO液或MD-H液处理后,与体外成熟卵母细胞进行授精,受精率分别为56.61％（17／30）和63.33％（19／30）,两组间差异不显著（P＞0.05）。BO和MD-H液均适宜于山羊精子获能处理。体外受精卵的2细胞胚发育率为16.67％（6／36）,4细胞胚发育率为2.78％（1／36）。     

TDZ与NaCl对滨梅离体培养再生的效应

在已建立的滨梅组织培养快繁的基础上,为了进一步提高滨梅繁殖的效率与质量,在培养基中附加TDZ和NaCl,其有效促进了滨梅不定芽的快速诱导与增殖。在添加质量浓度为1.0mg/L的TDZ时,可显著提高不定芽的增殖数,每个外植体增殖的芽数达(37.4±4.93)个,但茎高只有(0.80±0.07)cm,显著低于其他质量浓度TDZ(0.05,0.10,0.50mg/L)的处理;0.5mg/LTDZ处理的外植体,其芽增殖数为(26.6±3.59)个,与不加TDZ相比,差异显著,该处理的茎高则为(1.42±0.11)cm,与不加TDZ比较,没有显著差异;培养基MS ZT2.0mg/L BSA(牛血清白蛋白)30mg/L TDZ0.5mg/L对滨梅不定芽的增殖与生长是适宜的。在此基础上,于培养基中附加0.1%NaCl能更有效地提高不定芽的增殖,每个外植体芽增殖数为(29.83±1.74)个,与附加0和0.3%的NaCl相比,差异显著。TDZ和NaCl组合对滨梅快速繁殖是有效的,其适宜培养基是MS ZT2.0mg/L BSA30mg/L TDZ0.5mg/L 0.1%NaCl。经过壮苗培养后,在生根培养基诱导的根质量良好,有效地提高了小苗的成活率。     

抗生素对苹果离体叶片再生的影响

以昌红和姬神2个苹果品种无菌苗的离体幼叶为试材,分别接种在附加不同浓度卡那霉素（Kan,0、5、10、15、20、30、40和50mg／L）、头孢霉素（Cef,100、200、400和600mg／L）和羧苄青霉素（Carb,100、200、400和600mg／L）的MS＋TDZ1．0mg／L＋NAA0．5mg／L培养基上,暗培养14d后转移到光下培养,30d后进行再生指标统计,分析不同浓度Kan、Cef和carb对苹果离体叶片不定芽再生的影响。结果表明：Cef浓度为600mg／L、Carb浓度为400mg／L时完全抑制供试品种叶片的再生,Carb对昌红和姬神离体叶片抑制再生的作用比Cef强烈;昌红苹果对Kan非常敏感,Kan浓度为10mg／L时即能极显著抑制不定芽的再生,浓度为20mg／L时不定芽白化而不能正常生长。以苹果离体叶片的高频再生系统作为基因转化的受体系统,Kan适宜选择浓度为20mg／L。     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

体外法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖酶谱及其对育肥猪肠道微生物的影响

【目的】利用体外模拟法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖（NSP）酶谱,并分析优化的非淀粉多糖酶谱对饲粮养分消化率和育肥猪肠道微生物组成和结构的影响,为饲粮高效利用和精准饲养提供数据支撑和理论参考。【方法】试验一在育肥猪玉米—杂粕型饲粮中分别添加不同水平的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和果胶酶6种NSP酶,采用胃—小肠体外模拟法测定体外回肠干物质消化率（IVIDMD）;取IVIDMD达到最大值时各NSP酶的添加水平为该NSP酶0编码水平,按照六元二次回归正交旋转组合设计,进行体外消化试验,建立IVIDMD与NSP酶添加量的六元二次回归方程,筛选出玉米—杂粕型饲粮最优NSP酶谱（OEC）;利用胃—小肠—大肠体外模拟消化法分析测定添加OEC前后饲粮的体外干物质消化率（IVDMD）、体外能量消化率（IVGED）和体外消化能（IVDE）,以验证OEC的效果。试验二按照单因素完全随机设计,选用16头健康、体重相近去势公猪（117.8 ± 1.66 kg）,随机分为2个处理组,每个处理8头猪,对照组饲喂玉米—杂粕型基础饲粮,加酶组在基础饲粮中添加OEC;在试验开展第18天采用直肠擦拭法采集猪新鲜粪便,利用16S rRNA基因高通量测序对粪便微生物菌群的多样性及相对丰度进行分析,并进行功能预测。【结果】（1）在本试验条件下,玉米—杂粕型饲粮OEC为：纤维素酶1 003 U·kg^-1、木聚糖酶18 076 U·kg^-1、β-葡聚糖酶1 377 U·kg^-1、β-甘露聚糖酶14 765 U·kg^-1、α-半乳糖苷酶337 U·kg^-1和果胶酶138 U·kg^-1;（2）在玉米—杂粕型饲粮中添加OEC使IVDMD由73.44%显著提高到76.26%（P<0.01）,IVGED由74.03%显著提高到76.45%（P = 0.01）,IVDE由14.97 MJ·kg^-1显著提高到15.58 MJ·kg^-1（P<0.01）;（3）在门水平上,共筛选出了12个相对丰度大于0.1%的菌门,其中Bacteroidota（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Spirochaetota（螺旋体门）为优势菌门,三者之和在组内占比达96%以上;（4）在属水平上,饲粮中添加OEC显著增加norank_f_F082,norank_f_Bacteroidales_RF16_group,Bacteroides（拟杆菌属）和Roseburia（氏菌属）的相对丰度（P<0.05）,Eubacterium_ruminantium_group（P = 0.083）有增加的趋势,而Oscillibacter（颤杆菌克）的相对丰度显著降低（P<0.05）,Clostridium_sensu_stricto_1和norank_f__norank_o__WCHB1-41（P = 0.083）有降低的趋势（P = 0.052）。【结论】饲粮中添加体外法优化的NSP酶谱,显著提高了育肥猪玉米—杂粕型饲粮干物质和能量的体外消化率以及体外消化能,增加了纤维分解菌和产丁酸菌等有益菌在育肥猪肠道微生物中的占比,在一定程度上减少了有害菌的数量,优化了肠道微生态。     

不同热处理对黑豆干物质消化率,蛋白质消化率的影响

为了研究热处理的温度和时间对黑豆干物质消化率(DMD)、蛋白质消化率(PD)及脲酶活性的影响规律,对经过110℃和121℃下分别处理3,9和15min的饲用黑豆进行了离体干物质消化率和离体蛋白质消化率及脲酶活性的测定。结果表明:在121℃处理15min的样本干物质消化率和蛋白质消化率最高,分别为75.13%,90.91%,脲酶活性最低,为0.04mg/min·g。作者认为:在本研究范围内,湿热处理最适宜的温度是121℃,时间是15min。     

毛葡萄茎尖的离体培养与植株再生

为了建立毛葡萄茎尖离体培养及植株再生体系,给野生毛葡萄种质资源的超低温保存和无毒苗木培育提供参考,以花溪4和农院-11毛葡萄组培苗的茎尖为材料,研究植物生长调节剂及浓度配比对毛葡萄茎尖离体培养与植株再生的影响.结果表明:毛葡萄茎尖离体培养与增殖培养的适宜培养基为MS+ BA 1.5 mg/L+ IBA 0.02 mg/L,离体培养成活率达93.8％以上,增殖率和增殖系数分别为88.6％和5.8;茎尖生根培养的适宜培养基为1/2MS +IBA 0.05～0.15 mg/L +IAA0.2 mg/L,生根成苗率为100％,建立了毛葡萄茎尖组织培养和植株再生的技术体系.     

In Vitro Selection and Identification of Drought-Tolerant Mutants in Sweetpotato

In vitro selection of drought-tolerant mutants in sweetpotato cv. Lizixiang was studied by using PEG6000 as selection stress. Embryogenic suspension cultures were cultured in MS medium containing 0-35% PEG6000 and 2 mg L-1 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D). The results indicated that 30%PEG6000 can be used for the optimal selection stress of drought-tolerance. Embryogenic suspension cultures irradiated with 80 Gy gamma-ray were cultured in MS medium containing 30 % PEG6000 and 2 mg L-1 2,4-D and 20 drought-tolerant cell aggregates were obtained. These cell aggregates were transferred to solid MS medium supplemented with 2 mg L-1 2,4-D and formed embryogenic callus with somatic embryos. The embryogenic callus with somatic embryos was further transferred to MS medium supplemented with 1 mg L-1 abscisic acid (ABA), resulting in the germination of somatic embryos. In this study a total of 18 regenerated plants were obtained. The regenerated plants were transplanted in a greenhouse and 11 lines were formed. The analysis on drought treatment of seedlings, water retaining capacity of leaves and coefficient of drought-tolerance showed that 3 lines had significant drought-tolerance in comparison with the control plants.     

奶牛体外受精相关影响因素分析

[目的]探讨和研究奶牛体外受精（IVF）各技术环节中一些因素,对奶牛IVF整个过程的影响。[方法]研究不同来源的卵母细胞、精液的不同处理方法、不同的培养体系,不同受精时间,受精密度对奶牛IVF的影响。[结果]屠宰场采集的卵母细胞和活体采卵收集的卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率差异不显著;对精子分别采用percoll梯度密度离心和上浮法处理,两组的卵裂率囊胚发育率无明显差异,用SOF液和BO液体外培养,两培养体系的卵裂率和囊胚发育率均差异不显著;受精时间为8、10 h及10、12 h的囊胚发育率均差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精时间12 h;受精微滴（100μl）中放置成熟的卵母细胞数（20、40个）,两组的卵裂率和囊胚发育率均下降,且差异显著。[结论]随受精时间的延长,卵裂率和囊胚发育率逐渐降低,差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精12 h;受精微滴（100μl）中放置20个成熟的卵母细胞,可取得较好的体外受精效果。