羽衣甘蓝花粉SCR13-b基因的分离及其功能分析

 以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala) S_13-bS_13-b自交不亲和系为试验材料, 分离了控制花粉自交不亲和基因———S_13-b单倍型富含半胱氨酸基因(SCR_13-b) , GenBank收录号为EF577028。SCR_13-b cDNA序列含有237 bp的开放读码框(ORF) , 编码一个含78个氨基酸的蛋白。SCR_13-b gDNA含有一个758 bp的内含子, 内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU2AG规则; DNA blot分析表明SCR_13-b在基因组中只有单一拷贝; 授粉生物活性分析试验显示原核表达SCR132b融合蛋白能够启动SI反应, 抑制杂交亲和花粉的萌发和生长。     

羽衣甘蓝游离小孢子培养技术研究及应用

以10个羽衣甘蓝杂交种为试材进行游离小孢子培养,研究胚状体发生和小孢子胚成苗的影响因素,以及小孢子植株倍性鉴定和单倍体加倍方法。结果表明,盛花期为最佳取样时期;培养基中13%的蔗糖较为适宜;继代培养以MS+6-BA 2 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1为宜,平均增殖系数为5.06;小孢子再生植株成活率74.6%;小孢子植株自然加倍率为23.33%~37.50%;单倍体试管苗的加倍处理以秋水仙素浓度70 mg·L^-1,处理时间9~11d为宜,加倍率达54.55%。     

观赏羽衣甘蓝抗寒性评价

在5~-15℃不同低温处理下对观赏特征不同的5个羽衣甘蓝品系叶片的细胞膜透性、MDA含量、CAT、POD、SOD活性进行了研究。结果表明:各品系的细胞膜在-10℃时开始受到损伤;过氧化氢酶和过氧化物酶在整个处理范围内总体活性上升,尤其在-10℃时增加明显;超氧化物歧化酶在-10~-15℃变化不明显。综合各生理指标的结果,温度低于-10℃,羽衣甘蓝自身抗寒调节能力开始逐渐丧失。     

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸- 4 - 羟化酶基因的克隆及分析

 以羽衣甘蓝为材料, 克隆了全长2 431 bp的肉桂酸- 4 - 羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子, mRNA为1 715 bp, 编码一个481个氨基酸的推导蛋白, 与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序, 如血红素结合域、E - R - R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序( SRSs) 和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C₂₂₄₂单碱基缺失和相应移码, 导致其蛋白C - 末端缺失/变异了36个残基, SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失, 因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白, 可能定位于内质网, 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。     

球茎甘蓝小孢子培养中影响胚诱导的几个因素

以10份球茎甘蓝品种(系)为试材,采用游离小孢子培养方法,研究影响胚状体发生的因素。结果表明:基因型是影响胚状体发生的关键因素,不同基因型间胚诱导率存在显著差异;初花期为最理想的取蕾时期;添加适量激素能够提高胚诱导率,6-BA的适宜浓度为0.2mg·L-1,NAA的作用因基因型而异;4℃低温预处理24h可以明显提高胚诱导率;添加0.25mg·mL-1活性炭不仅可以显著提高胚诱导率,而且能够改善胚状体发育状态。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究

以庆农70和庆农80为试材对青花菜小孢子胚状体植株再生因素进行研究。结果表明:胚龄为30～35d且发育健壮的子叶形胚再生成苗率最高,超过75%,胚龄超过40d再生成苗率显著降低;琼脂浓度为1.2%时,小孢子胚再生成苗率最高,达60%～70%;大多小孢子胚不能直接成苗,二次分化频率较高;植株继代和复壮培养适宜培养基为MS+3%蔗糖+1.0%琼脂;小孢子再生植株一半左右为单倍体,二倍体率为30%～35%,存在少数四倍体和嵌合体。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

RAPD标记构建芥蓝×甘蓝分子标记连锁图

 以芥蓝C_100-12×甘蓝秋_50-Y7为杂交组合, 构建了F₂ 作图群体, 利用300 个随机引物对两亲本进行了RAPD 检测, 共筛选到150 个RAPD 引物在亲本间表现多态, 多态引物的比率为58. 3 %。共分析了52个引物产生的96 个多态性RAPD 标记在该群体中的遗传。96 个RAPD 标记中有94 个在F2 群体中的分离比符合3∶1 , 说明该群体适合于QTL 分析, 共发现两对共分离的RAPD 标记。利用该作图群体构建了甘蓝的基本遗传图谱。该图谱由9 个主要的连锁图构成, 覆盖基因总长度约为555. 7 cM。     

花椰菜游离小孢子培养研究进展

分析了影响花椰菜游离小孢子培养的主要因素(材料基因型、小孢子发育时期、预处理和预培养、培养基成分、培养技术),并对胚状体发生与植株再生、DH纯系获得等的研究情况进行了阐述,展望了游离小孢子培养技术发展前景.     

甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测

 S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)分别为甘蓝自交不亲和(self-incompatibility, SI)信号传导的雌雄决定因子。为了深入研究两者的作用机理和进行人工调控,本研究以结球甘蓝ZQ为材料,利用pET·NusA融合蛋白表达系统,将包含SRK胞外域和跨膜域的mSRK蛋白和SCR蛋白在大肠杆菌BL21中融合表达,经SDS-PAGE电泳检测表达出融合蛋白大小分别约为116 kD和74 kD。进一步将两融合蛋白进行体外相互作用的检测,结果表明mSRK与SCR蛋白能够相互结合形成稳定的复合体,这为下一步实现SRK-SCR复合体聚合与解离的人为调控提供了技术平台。     

抱子甘蓝组织培养及人工种子研究

以抱子甘蓝下胚轴为外植体诱导再生植株,并制作人工种子。结果表明:苗龄为8d的无菌苗,其下胚轴诱导不定芽频率最高,平均诱导不定芽数达11.3个。6-BA、ZT对下胚轴诱导不定芽均具有明显的促进作用,6-BA2mg·L-1作用最显著,繁殖系数达11.2。不定芽在不含激素的1/2MS培养基上诱导生根,驯化移栽后成活。将不定芽用海藻酸钠包埋成人工种子,生根率为24%,移栽成活并开花。     

花椰菜细胞质雄性不育系的细胞学研究

以花椰菜细胞质雄性不育系09-R9为试材,以可育材料24为对照,采用常规石蜡切片技术,对花椰菜细胞质雄性不育系的花药败育过程进行细胞学研究。结果表明：花椰菜细胞质雄性不育系的花药可以形成部分外形正常的花粉囊,但囊内物质随着花蕾的发育逐渐解体,最终这种不正常的花粉囊全部解体消失。不育系花药发育受阻于花粉母细胞形成之前,此时花粉囊内未见绒毡层,可能是其本身并未形成绒毡层。     

结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析

分别以自花授粉30 min、异花授粉30 min和未授粉处理的甘蓝柱头进行Illumina HiSeq2000高通量转录组测序,分析自交不亲和性甘蓝自花授粉、异花授粉柱头与未授粉柱头中基因表达的差异。转录组测序共获得1.6 × 108对原始序列读取片段,总碱基数为2.38 × 1010 bp,与未授粉对照相比,自花、异花授粉后差异表达的基因分别有2 900个和2 328个,共有的差异表达基因1 904个。在差异表达基因背景和全部基因背景下,自花授粉较大比例的差异基因是细胞杀伤、胞外基质部分和核酸结合转录因子活性;异花授粉较大比例的差异基因是信号传递、胞外区域部分、结构分子活性和营养库活性。GO功能的显著性富集分析表明,自花授粉处理后特有的40个极显著的富集条目主要涉及糖跨膜转运活性、微管结合和钙调素依赖性蛋白激酶活性等。异花授粉特有的53个极显著的富集条目主要涉及法尼酸O–甲基转移酶的活性、微管负向运动和生长素跨膜运输等。自花授粉处理后特异差异表达的996个基因主要涉及钙离子结合、细胞骨架相关、茉莉酸和水杨酸代谢等生物过程,异花授粉处理后特异差异表达的424个基因主要涉及物质跨膜转运及脂质代谢。     

青花菜氮磷钾施肥效应研究

运用"3414"田间试验设计,在蔬菜主产区设置氮磷钾肥料试验,获得了青花菜氮、磷、钾的一元二次效应模型分别为:Y=891 45.02N-0.884N2(R=0.858),Y=1118 37.4P-1.229P2(R=0.568),Y=1060 16.37K-0.113K2(R=0.752);青花菜最高产量的氮磷钾理论施肥量:N为385.5kg/hm2;P2O5为151.5kg/hm2;K2O为274.5kg/hm2。     

花椰菜和小白菜种间杂种子房培养研究

以小白菜雄性不育系h08015为母本,以花椰菜自交系082005、082009、082010、082063为父本进行种间杂种离体子房培养。结果表明：离体培养时杂种子房发育天数、接种方式、激素水平及父本基因型对杂交种子发芽率均有明显影响。授粉后6 d的子房培养能获得较好的效果;4 d后剥取种子继续培养,获得的种子发芽率高于其他接种方式;不加激素的MS培养基好于添加6-BA及NAA的MS培养基;不同父本基因型最适取材时间不同,多数基因型最佳培养时间为授粉后6 d的子房,个别基因型则是授粉后10 d的子房。     

不同肥料处理对青花菜产量和品质的影响

研究了不同施肥处理对青花菜产量与主要品质指标的影响,试验结果表明,生物有机肥能提高青花菜的产量和品质,效果以酵素菌生物有机肥和复合微生物肥复配最显著,有机肥对产量和品质无显著影响。2种生物有机肥复配使青花菜产量提高20.78%,抗坏血酸、可溶性蛋白、可溶性糖、干物质含量分别提高34.2%、46.0%、43.8%、6.13%。     

甘蓝显性雄性不育系的选育及其利用

从甘蓝原始材料７９－３９９的自然群体中获得雄性不育突变株７９－３９９－３。研究结果表明，该突变株的雄性不育受一显性不育基因ＣＤＭｓ３９９－３控制。该基因在不同的遗传背景下表现为环境敏感和环境稳定两种类型，且温度是影响不育稳定性的主要因素。环境敏感的显性雄性不育植株通过自交可以得到显性纯合的雄性不育植株。显性纯合不育植株与普通自交系或相应的姊妹系杂交获得了不育株率达到１００％、不育度达到或接近１００％的不育群体。根据ＣＤＭｓ３９９－３基因的这一遗传特点，建立了利用显性雄性不育基因配制甘蓝杂交种的新方法：利用组织培养技术保存和繁殖显性纯合雄性不育材料，然后与遗传差异较小的普通自交系或姊妹系杂交得到不育系。选择园艺性状优良、不育性稳定的不育群体作不育系，与配合力优良的自交系杂交，配制出了优良的杂交组合。试验采种结果表明，携带ＣＤＭｓ３９９－３基因的甘蓝雄性不育系结实性状优良     

两个花椰菜品种再生体系的研究

以2个花椰菜品种的子叶和上胚轴为外植体,以MS为基本培养基,设置不同激素浓度,建立再生体系。结果表明:子叶作为外植体时不定芽分化率低,子叶大部分发生黄化。上胚轴作为外植体不定芽分化率较高,在适合的培养基上均能达到100%,‘祁连白雪’上胚轴最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L,‘新东海明珠80天’的最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+IAA0.5 mg/L。分化后得到的不定芽在MS+6-BA 0.5 mg/L培养基上伸长后,在MS+IAA 0.5 mg/L的培养基上生根,生根率达100%,移植成活率95%。