猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。     

猪博卡病毒研究进展

 猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。目前,在匈牙利、北爱尔兰、罗马尼亚、泰国、日本、韩国和中国的猪群（野猪）中均检测到了该病毒,并且发现该病毒在猪群中保持较高的感染率。流行病学调查研究发现,该病毒与猪群腹泻有一定的相关性,并且可能在猪腹泻中可能扮演了一个诱因的角色。通过基因序列分析和系统发育分析发现,该病毒存在多个谱系,呈现出遗传多样性的特点。     

猪嵴病毒PCR检测方法的建立及其应用

本研究根据GenBank上猪嵴病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,建立猪嵴病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好。应用该PCR方法对2010年在上海周边地区采集的116份猪粪样品进行检测,结果45份为猪嵴病毒阳性,表明上海地区猪群中猪嵴病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以用于猪嵴病毒的流行病学监测。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

猪Hokovirus PCR检测方法的建立及其应用

猪Hokovirus(PHoV)是近年来在香港发现的一种猪细小病毒。为及时评估该病毒在我国的感染及流行情况,本研究根据GenBank中登录的PHoV核苷酸序列设计并合成一对特异性引物,建立了PHoV的PCR检测方法。研究结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,对其它的猪主要病毒无交叉反应;敏感性较高,最低可以检测2.4×104拷贝/μL;而且重复性较好。采用该方法对2009年～2010年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果显示38份样品为PHoV阳性,表明我国猪群中存在PHoV感染。本研究建立的PCR方法可以作为在临床上检测PHoV的一种有效手段。     

两株猪博卡病毒的检测及遗传演化分析

根据Gen Bank公布的猪博卡病毒序列,设计特异性引物,分别对猪博卡病毒(PBo V)的NS1基因、NP1基因、VP1/VP2全基因进行PCR方法测定,所得到的2个阳性样本分别命名为GD4和GD18。各基因遗传分析表明:GD4和GD18株各基因同源性较低,在34.9%⁵0.5%之间;猪博卡病毒主要分为3个大的分支,GD4和GD18分别处于不同的分支;分别与HQ223038和KF206167亲缘关系较近。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

根据已报道的猪细小病毒基因组序列，设计并合成了1对寡核苷酸引物，通过对影响PCR扩增因素的筛选，成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段，回收该片段用EcoR I酶切得到了预期的结果，证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明，该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病科的检测，查出阳性16份，而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本试验建立的PCR诊断方法灵敏度高、特异性强。     

猪博卡病毒的研究进展

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。在欧洲、美洲、中国、韩国、日本均检测到了猪博卡病毒的存在,流行病学调查研究发现,该病毒与猪群腹泻和呼吸困难有一定的相关性。本文结合已发表的文献,对猪博卡病毒的流行病学、分类、基因组结构与致病性等方面进行了阐述,为科研人员对猪博卡病毒的研究提供理论依据。     

猪博卡病毒3/4/5型PCR检测方法的建立及应用

通过分析GenBank上登录的猪博卡病毒3/4/5型(PBoV3/4/5型)基因序列,发现这些基因序列中存在一段高度同源性保守序列,针对该序列设计并合成1对引物,成功建立了可同时扩增出PBoV 3/4/5型的PCR检测方法。对2013年8月至2014年5月河南省50份临床腹泻仔猪小肠样品进行检测,结果 21份为PBoV阳性,阳性率为42%,表明PBoV在河南省猪群中存在一定流行。本试验建立的PCR方法对PBoV3/4/5的检测具有简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点,为PBoV 3/4/5型的快速检测提供了有效的技术支持。     

猪博卡病毒病原学和检测方法研究进展

猪博卡病毒是2009年新发现的一种猪细小病毒,近几年来在我国感染率日益升高,且常常与其他病原混合感染,增加了疫病防控的难度。论文就猪博卡病毒病原学与检测方法做一综述,为提高我国猪博卡病毒的综合防控能力提供参考。     

A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。     

猪源TTV Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区（UTR）的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品分别绘制标准曲线,TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。检测结果显示,两种方法的灵敏度均可达10 copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。检测采集自广西和内蒙古的44份病料,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。     

PCV2a与PCV2b鉴别诊断PCR方法的优化及应用

猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）是严重危害养猪业的重要病原之一,根据基因组大小可分为2个基因型：PCV2a和PCV2b。为更好地掌握PCV2a和PCV2b在我国猪场的流行情况,本研究对先前的鉴别PCR诊断方法（涉及到引物、PCR体系及程序）进行优化,并应用优化的鉴3qPCR方法对1184份PCV2阳性样品进行检测,结果显示PCV2a占30．5％（36／118）,PCV2b占37．3％（44／118）,共感染占32．2％（38／118）,与常规PCR检测结果符合率为100％,此外,对30份,瞄床送检组织和血清样品也有很高的检出率。部分鉴别PCR扩增的目的产物进行测序及序列进化树分析,表明扩增序列为PCV2a与PCV2b的特征序列。经本研究优化后的鉴别PCR方法易操作、特异性强、敏感性好,可广泛用于临床样品中PCV2a和PCV2b的快速检测。     

上海市猪博卡病毒感染情况调查

根据GenBank公布的猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV)序列,在VP1/2基因区域设计引物和TaqMan探针建立实时荧光定量PCR检测方法,对上海市10个区(县)规模场2006～2011年间采集的1800份猪血清、2010年种猪场不同月份采集的45份猪粪便、2010年9个规模场采集的27份猪鼻棉拭以及门诊采集的9份高热病死猪内脏进行检测,阳性率依次为24％、30％、0％、67％.6份PBoV阳性病料进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)检测,阳性率依次为83％、100％、0％、0％.检测结果表明,PBoV感染在上海市普遍存在,猪内脏中检出率较高,且春秋两季高发,仔猪比较易感,并与PRRSV、PCV2存在混合感染.     

TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2％,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92％,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

应用ELISA间接法检测猪流行性腹泻抗体的研究

应用猪流行性腹泻病毒(PEDV)吉(J)毒株猪胎肠单层细胞培养物,以冻融法制备抗原,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法检测PED抗体的方法。对30头份经直接免疫荧光技术证实的PED病猪群血清测定,97％为阳性;检测32头份无PED猪场猪血清,93％为阴性。对1份PED“华毒株”,1份“川毒株”以及3头份“吉毒株”PED免疫血清测定,均为阳性。对猪传染性胃肠炎血清、猪轮状病毒病血清、疑似猪血球凝集性脑脊髓炎血清、鸡传染性支气管炎血清及猪梭菌性肠炎血清共16头份检测均为阴性,证明PEDV不与TGEV等其它3种冠状病毒血清发生交叉反应。89头份疫区猪血清的区域性试验阳性率为75％(67/89);对82头份屠宰猪血清测定,53％阳性。抗原包被板保存期试验表明,包被板在-20℃可保存2个月。     

H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法的建立及初步应用

虽然H3、H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是低致病性禽流感病毒,但其具有跨宿主感染哺乳动物的能力,对社会公共卫生安全具有重大的潜在危害,因而对这些亚型病毒的监测极其重要。通过比对GenBank上H3、H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了分别针对H3 AIV和H9 AIV的特异性探针。特异性试验和标准曲线试验的结果显示,这两个探针仅分别特异性识别H3、H9亚型AIV,且具有较好的扩增效率。通过重组质粒pMD19-T-H3HA和pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行敏感性实验。结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法能检测到100个DNA拷贝数H3 AIV和10个DNA拷贝数的H9 AIV,比传统PCR方法敏感性分别提高了100倍和1000倍。此外,本方法还能检测到10 EID50的H3亚型AIV或H9亚型AIV,比传统PCR方法检测敏感性均提高了1000倍。批间和批内试验的变异系数均小于3%,表明本研究建立的方法具有较好的重复性。此外,与传统PCR方法相比,用H3、H9亚型AIV双重荧光定量PCR方法检测人工感染动物的肺组织时,针对H3 AIV的敏感性提高了10~100倍,针对H9 AIV的敏感性提高了100倍。综上所述,本研究所建立的H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的特异性和敏感性,对H3、H9亚型禽流感病毒监测具有重要的应用价值。     

猪细小病毒分离,核酸探针研制及应用

采用分子克隆技术制备了ＰＰＶ－ＤＮＡ－Ｃ片段（ＰＰＶ－ＲＦ－ＤＮＡ,经Ｐｓｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ⅲ的双酶切片段,称为Ｃ片段）及含Ｃ片段的ＰＵＣ１９重组质粒（ＰＵＰ）,利用地高辛标记,分别制备探针２和探针１。对猪细小病毒ＤＮＡ进行斑点杂交,两种探针均为阳性,而对照的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒及ＰＫ－１５细胞的核酸均为阴性。并且后一种探针的敏感性高于前者,两种探针的ＤＮＡ检出限量分别为４０ｐｇ和     

牛诺如病毒及牛嵴病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据BNoV和BKoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,建立了能同时检测牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNo V)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKo V)的双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增BNo V和BKo V的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105 copies/μL和2.23×106 copies/μL;对临床采集的127份犊牛腹泻样品检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKoV的阳性率为4.72%(6/127),两者与单一PCR检测结果相一致,符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,可用于BNoV和BKoV的快速检测和流行病学调查。