水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。     

水稻细菌性条斑病菌的血清学特异性

从水稻细菌性条斑病菌的细胞中抽提出两大类抗原物质。一类是黄色的蛋白南，其中某些抗原成分为水稻白叶枯病菌和５个野油菜黄单胞菌致病变种的共同抗原，是非特异的；另一类是白色的蛋白质，是特异的其相对应的抗血清在琼脂双扩菜试验中，与来自不同省、区的水稻细菌性条斑病菌稳定地形成２条清晰的沉淀带，而与水稻白叶枯病菌和５个野油菜黄单胞菌致病变种不起反应。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌在不同培养基上的回收率测定

选用523培养基(523)、营养培养基(NA)和改良胁元培养基(WF—P)对水稻白叶枯病菌(B—3)和条斑病菌(A—1)的回收率测定结果表明,病原菌的回收率范围为12.3%～76.6%,其中A～1的平均回收率较高,达61.5%.B—3的平均回收率很低,仅为26.3%.同一菌株在不同培养基上的回收率亦存在明显差异,A—1在NA上的回收效果最佳,回收率达75.9%.在523和WF—P上较差;WF—P对B—3的回收率亦达46.1%,几乎是523和NA培养基的3倍.WF—P和NA可分别作为检测水稻白叶枯病菌和条斑病菌的基础培养基.     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola,Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）合成基因,avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae,Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点,把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上,获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上,获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105,把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99,通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现,lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示,基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关,前两基因的突变导致细菌完全失去毒性,而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型,在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此,本试验证明,以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

应用选择性培养基和McAb技术检测种子中水稻细菌性条斑病菌研究初报

对ＳＸ，ＮＢＹ，Ｗａｋｉｍｏｔｏ３种培养基进行筛选，结果表明，改良Ｗａｋｉｍｏｔｏ比较适合于作为检测种子中细菌性条斑病菌的基础培养基。把甲基绿和甲基紫加到Ｗａｋｉｍｏｔｏ培养基组成选择性培养基改良Ｗａｋｉｍｏｔ，应用单克隆抗体（ＭｃＡｂ）进行玻片滴定法，把培养基上产生的黄色菌落进行鉴别，便可检测出细条病菌，并应用于药剂消毒种子的效果检测上。     

一种高效分离水稻细菌性条斑病菌的新方法

[目的]介绍一种将常规方法改进成为一种适用于分离存放时间过久的细条病样本的新方法。[方法]用注射器渗压法将病害标本的研磨液接种水稻叶片形成新鲜病斑后,再按改进的常规方法进行分离纯化。[结果]该新方法分离纯化可直接得到单菌落。[结论]该方法是一种适用于分离存放时间过长的水稻细菌性斑条病菌标本的方法。     

水稻细菌性条斑病菌胞外产物的性状

对水稻细菌性条斑病菌胞外产物（胞外多糖,蛋白酶、果胶酸酯裂解酶,聚半乳糖醛酸酶,纤维素酶,淀粉酶,半纤维素酶）的部分特性以及不同菌株离体产生各胞外产物能力与致病力的相关性进行了初步研究。发现病菌在离体条件下分泌的各胞外产物总量和单位产量随培养时间的增长而增加,至一定的阶段后趋于稳定。不同培养基下各胞外产物的产生有所变化,但对各菌株之间单位产量的差异影响不大。病菌产生的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤     

西南地区水稻细菌性条斑病菌致病力的分化

以水稻品种IRBB4、IRBB5、IRBB14、IRBB18、IRBB21和IR24为鉴别品种,在孕穗期,采用针刺接种的方法,将水稻条斑病菌接种在水稻剑叶上,根据病菌与品种互作反应和亲和性的类型差异,将供试的75株条斑病菌菌株区分为13个小种群.大多数水稻条斑病菌株在鉴别品种上的互作反应表现为弱互作模式.云南、贵州、四川3省菌株小种组成的比较表明:以小种C9为目前3省的共同优势种群;云南省小种组成多样,所有的小种均有分布,贵州小种类型有6、9、11、13,四川小种类型有3、4、6、7、9、11、12、13,小种的分布受地理区域的影响.     

水稻细菌性条斑病菌DNA多态性与致病性研究

利用６０个随机引物对来自我国不同稻区的水稻细菌性条斑病菌株基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增,其中２０个引物均出现清晰和重复性的ＤＮＡ扩增片段,扩增片段大小在０．５ｋｂ至３．５ｋｂ;应用Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ软件ＵＰＧＭＡ程序进行树状聚类分析,聚类结果表明,我国水稻细菌性条斑病菌具有明显的遗传分化,在遗传距离为０．３０时,供试菌株可划分为７个遗传相似组（谱系）。其中第１、第２和第５组为优势组群,分别由７、８、６个菌株组成。根据菌株在１２个已知基因品种上的抗感反应,将供试菌株分为１３个致病型,在遗传距离为０．５０水平上聚类归属于６个簇。菌株的致病类群与其ＤＮＡ的遗传变异具有弱相关性。     

西南地区水稻细菌性条斑病菌的遗传多样性分析

选取云南、贵州、四川不同省市地区的水稻条斑病菌菌株141株,利用Rep-PCR技术筛选出多态性较好的引物对其DNA进行多态性分析.引物J3、ERIC、JELIR的扩增多态性较好,不同毒性菌株间的Rep-PCR指纹图谱差异很大.通过聚类分析显示,我国西南地区的水稻细菌性条斑病菌群体遗传分化明显,菌株的遗传族群与其致病性具有一定的相关性,强、中、弱毒性菌株大致归为不同的类群.因此,Rep-PCR技术可用于检测水稻细菌性条斑病菌的遗传变异与鉴定研究.     

水稻细菌性条斑病菌单克隆抗体的分类及其单抗血清型研究

用水稻细菌性条斑病菌免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠民鼠骨髓瘤细胞杂交融合，建立了５株分泌抗水稻细菌性条斑病菌的特异性，有鉴别力的杂交瘤细胞株：Ｍ２３、Ｍ６、Ｍ１７、Ｍ２６０、Ｍ２９。这５株单抗分别与来自不同区域的１２８株水稻细菌性条斑病菌进行酶联免疫吸附地试验，结果表明：可将这些菌株识别出５个抗原决定簇，区分出了７个单抗血清型据此我们认为以单抗作为菌分类的依据是可行的。     

广东水稻细菌性条斑病菌致病性分化研究

水稻抗病性是寄主与病原物互作的结果,病原菌系的分化研究是抗病资源筛选及抗病育种的前提。研究以水稻品种金刚30、IR24、IRBB21、IRBB14、IRBB5、IRBB4、五山丝苗等为鉴别品种,对来自广东地区72个细菌性条斑病菌菌株进行致病力分化测试,并开展了部分广东主栽品种对广东细菌性条斑病菌优势菌系抗性鉴定。结果表明,广东地区的细菌性条斑病菌菌株致病力分化明显,测试菌株可分为19个致病型,其中优势致病型为C18(SSSSRSS)和C5(SRRRRRS),分别占25%、23.61%;强致病性菌系菌株C17(SSSRSSS)、C18(SSSSRSS)、C19(SSSSSSS)占测试菌株的27.78%,主要分布在广州、惠州、阳春、茂名、新会、广宁、雷州地区。测试18个广东主栽品种中,除新银占对测试的优势菌系C18(SSSSRSS)表现中感,其余的均表现感病。     

抑制水稻细菌性条斑病菌的植物筛选

以水稻细菌性条斑病菌为供试菌,对12种植物甲醇提取物进行离体抑菌活性测定,发现霸王鞭和佛甲草的甲醇提取物抑菌活性最好。分别采用菌丝生长速率法和抑菌圈法测定了佛甲草甲醇提取物对6种植物病原细菌和12种病原菌物的抑制作用,发现该提取物对5种供试细菌有抑制作用,其中对水稻细菌性条斑病菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径达到21.67mm;对8种病原菌物有一定的抑制作用,对4种病原菌物菌丝的生长具有促进作用。以浓度为300mg/mL的佛甲草甲醇提取物对水稻细菌性条斑病进行离体和盆栽防治试验,先喷药后接种,离体和盆栽的防治效果分别为85.19%和66.67%;先接种后喷药,离体和盆栽的防治效果分别为69.63%和57.65%。研究结果初步证实,佛甲草中含有强烈抑制水稻细菌性条斑病菌的抑菌物质。     

水稻细菌性条斑病菌胞外产物的性状

对水稻细菌性条斑病菌胞外产物（胞外多糖、蛋白酶、果胶酸酯裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶）的部分特性以及不同菌株离体产生各胞外产物能力与致病力的相关性进行了初步研究．发现病菌在离体条件下分泌的各胞外产物总量和单位产量随培养时间的增长而增加,至一定的阶段后趋于稳定．不同培养基下各胞外产物的产生有所变化,但对各菌株之间单位产量的差异影响不大．病菌产生的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶活性最适ｐＨ值分别为９．０、６．０、８．０、４．０、８．０．其蛋白酶活性与致病力呈显著正相关,果胶酸酯裂解酶与致病力呈正相关．病菌除去胞外产物后,降低了在水稻叶片上的吸咐和增殖能力．强致病力菌株胞外产物对离体稻叶的伤害能力要强于弱致病力菌株．